肠道内硫酸盐还原菌的多样性分析

发布时间：2017-06-25 15:13

  本文关键词：肠道内硫酸盐还原菌的多样性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：硫酸盐还原菌（sulfate reducing bacteria, SRB）是类以硫酸盐为呼吸链终端电子受体从而氧化有机物和氢气以获取能量的类厌氧微生物。硫酸盐还原菌不仅抑制酸盐的产生，而且消耗肠道内已有的 酸盐；硫酸盐还原菌的主要产物之是硫化氢（H2S），它调节胰岛素的分泌、抑制酸盐的氧化、影响动物细胞的呼吸、对动物细胞有遗传毒性和细胞毒性；革兰氏阴性菌硫酸盐还原菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱发炎症的能力强。硫酸盐还原菌的这些特性都表明它可能是肠道内具有重要功能的类细菌。已有报道显示SRB可能与结肠炎、结肠癌、肠道易激综合征、代谢综合征等疾病的发生发展有关。 本研究的第部分内容是建立肠道硫酸盐还原菌的DGGE分析技术。依据文献挑选了两对硫酸盐还原菌腺苷酰硫酸还原酶α亚基基因（adenosine-5'-phosphosulfate reductase alpha subunit gene, aprA）的特异性引物：AprA-1-FW/AprA-5-RV和AprA-3-FW/APS-RV。从GenBank中下载了13株脱硫弧菌科细菌的aprA的序列，利用Clustal X、Simulated PCR（SPCR）软件比较、评估了这2对引物用于扩增粪便样品中的SRB的特异性。它们的结果均表明引物AprA-3-FW/APS-RV优于AprA-1-FW/AprA-5-RV。实际PCR的结果也显示AprA-1-FW/AprA-5-RV扩增效率低并有非特异扩增。在此基础上建立DGGE体系，对10例健康人肠道中SRB的分析显示，每个个体肠道中SRB的种类有1到5种不等，这表明基于aprA序列的DGGE技术是分析肠道SRB组成的有效方法。 本研究的第二部分内容是分离培养人肠道中的SRB菌株并分析其多样性组成。选择1名糖尿病患者（D）、1名健康老年人（S）和1名健康青年人（H）作为分菌对象，采集新鲜粪便样品进行SRB的分离。从糖尿病患者样品中分离得到了150株SRB菌株分属4种ERIC-PCR型；从健康老年人样品中分离到96株SRB菌株，分属2种ERIC-PCR型；健康青年人志愿者的样品中未能分离到SRB菌株。对分离株的代表菌株进行16S rRNA基因全长和aprA基因片段的测序，通过GenBankBlast、系统进化树等分析确定这些菌株都属于脱硫弧菌属（Desulfovibrio）细菌。本研究也对3名志愿者肠道中的SRB组成进行了aprA基因的克隆文库分析和DGGE分析，并与培养的结果进行了比较。结果显示，从糖尿病患者样品中分离到的SRB菌株与D.intestinalis99%相似，是该样品中SRB的种优势种；从健康老年人样品中分离到的菌株与D. desulfuricans99%同源，是该样品中最主要的种SRB；健康青年人样品虽未分离到SRB菌株，，但分子检测显示其含有D. desulfuricans等类型。与培养方法相比，克隆文库分析和DGGE等分子技术分析SRB更全面，SRB的多样性也高于培养方法的结果。 综上所述，本研究先建立了肠道硫酸盐还原菌的DGGE分析技术，并结合厌氧纯培养以及分子技术分析了3名志愿者肠道内SRB的多样性；发现每个个体肠道内有3到6种SRB，并分离得到了位糖尿病患者和位健康老年人肠道内的优势SRB菌株；为后续进步研究SRB的生理特性及与糖尿病的关系奠定了基础。
【关键词】：硫酸盐还原菌 肠道菌群 糖尿病 DGGE 厌氧培养 ERIC-PCR 克隆文库
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R37
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文献综述12-40
• 1.1 硫酸盐还原菌研究进展12-18
• 1.1.1 硫酸盐还原菌的定义和分类12-15
• 1.1.2 硫酸盐还原菌的代谢15-17
• 1.1.3 肠道内硫酸盐还原菌研究进展17-18
• 1.2 肠道硫酸盐还原菌与人类健康的关系18-26
• 1.2.1 肠道菌群简介19-21
• 1.2.2 肠道菌群结构与肥胖的关系21
• 1.2.3 肠道菌群结构与二型糖尿病的关系21-23
• 1.2.4 硫酸盐还原菌致病机制探讨23-26
• 1.3 本论文中微生物分子生态学技术和纯培养技术介绍26-33
• 1.3.1 微生物分子生态学技术27-32
• 1.3.2 研究肠道微生物的纯培养技术32-33
• 1.4 参考文献33-40
• 第二章 建立分析肠道内硫酸盐还原菌组成的 DGGE 技术40-61
• 引言40-41
• 2.1 材料和方法41-49
• 2.1.1 引物和 aprA 基因序列41-42
• 2.1.2 样品采集42
• 2.1.3 主要试剂和仪器42
• 2.1.4 DNA 提取42-44
• 2.1.5 肠道 SRB 特异性引物评价44-45
• 2.1.6 DGGE 分析45-49
• 2.2 结果49-56
• 2.2.1 肠道 SRB 特异性引物的比较和确定49-51
• 2.2.2 DGGE 体系的摸索和建立51-56
• 2.3 讨论56-58
• 2.4 本章小结58
• 2.5 参考文献58-61
• 第三章 肠道内硫酸盐还原菌的分离和多样性分析61-94
• 引言61-62
• 3.1 材料和方法62-72
• 3.1.1 分离和培养硫酸盐还原菌62-69
• 3.1.2 分子方法研究粪便中 SRB 的多样性69-72
• 3.2 结果72-87
• 3.2.1 硫酸盐还原菌的分离和培养72-73
• 3.2.2 硫酸盐还原菌分离株的分子鉴定73-74
• 3.2.3 硫酸盐还原菌分离菌株分型74-76
• 3.2.4 ERIC 类型代表菌株的分类地位76-80
• 3.2.5 分子方法分析肠道内 SRB 的多样性80-87
• 3.3 讨论87-90
• 3.4 本章小结90
• 3.5 参考文献90-94
• 附录 1 缩写和全称94-96
• 附录 2 溶液试剂及培养基配方96-98
• 附录 3 仪器设备98-99
• 研究生阶段已（待）发表论文99-100
• 致谢100-101

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 殷晓晨;费娜;肖水明;申剑;赵立平;庞小燕;;重度肥胖症患者膳食干预前后肠道内硫酸盐还原菌的定量检测[J];中国微生态学杂志;2012年08期

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本文编号：482585