蓖麻毒素单克隆抗体的制备

发布时间：2017-06-26 07:19

  本文关键词：蓖麻毒素单克隆抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蓖麻毒素（Ricin）是一种核糖体失活蛋白，由A、B两个肽链以二硫键共价相连接，其A链在B链的协助下，容易穿透细胞膜，通过切断一个N-糖苷键破坏核蛋白体60S亚单位，抑制蛋白质合成，导致细胞死亡。目前，A链和B链的氨基酸序列以及二级结构已基本清楚。毒素B链上含有两个半乳糖或半乳糖残基结合位点，可和细胞表面的含半乳糖残基结合，通过受体介导的内吞作用进入细胞质，发挥毒性作用。蓖麻毒素A、B链上还分别含有1和2个糖支链，链末端均为甘露糖残基，而网状内皮细胞、特别是巨噬细胞表面富含甘露糖受体，可优先摄取蓖麻毒素，这对于毒素的生物功能具有重要意义。 蓖麻毒素来源广泛，较容易提取，而且性质稳定。蓖麻毒素的毒性作用机理研究，丰富了人们对蓖麻毒素毒性作用的认识，由于蓖麻毒素毒性强，目前还没有特效解毒药及预防疫苗。近十年来，国内外军事医学专家越来越担心恐怖组织运用蓖麻毒素进行恐怖袭击。美国疾病控制中心把蓖麻毒素列为 B‖武器——具有中度威胁。在《禁止化学武器公约》中，被列为最为严格的控制对象之一。 蓖麻毒素的侦检，是军事医学及反恐斗争研究的重要内容。基于特异性抗体建立的免疫分析方法，具有特异、灵敏和快速等特点。制备蓖麻毒素特异性单克隆抗体是建立该毒素检测分析方法的基础。同时，高亲和力的抗毒抗体可以用于蓖麻毒素中毒被动免疫治疗。因此，为建立灵敏、快速检测蓖麻毒素的方法，筛选可能有效的抗毒抗体，我们以原核表达的蓖麻毒素A、B链为免疫抗原，制备了抗蓖麻毒素的单克隆抗体，用于蓖麻毒素检测分析及抗毒治疗研究。 Ricin几乎对所有真核细胞具有很强的毒害作用。考虑到Ricin是通过RTB（蓖麻毒素B链蛋白）的糖基受体介导毒素的细胞内转运，发挥RTA(蓖麻毒素A链蛋白)的蛋白合成抑制活性，且全毒素免疫毒性较大等原因，我们构建pET28a-RTA、pET28a-RTB原核表达载体，转化大肠杆菌BL21，诱导RTA、RTB融合蛋白的可溶性表达，超声裂解表达后菌体，利用融合蛋白上的组氨酸标签进行亲和层析纯化目的蛋白，免疫小鼠制备单克隆抗体。 实验方法：构建原核表达载体，用于RTA、RTB在E.coli(大肠杆菌)中表达。纯化重组A、B链蛋白。以重组蛋白免疫小鼠，以重组蛋白进行初筛，以天然毒素蛋白进行确证分泌抗体的细胞株。ELISA方法分析抗体的抗原表位，细胞实验进行抗毒活性初步探讨，建立糖基蛋白-Ricin-单克隆抗体-HRP标记羊抗鼠抗体的夹心ELISA方法。 实验结果：构建了pET28a-RTA和pET28a-RTB系列重组质粒载体，将其转入大肠杆菌BL21(DE3)后表达了可溶性的融合蛋白。通过镍柱亲和纯化RTB，蛋白纯度在90%以上，可以用于作为抗原去免疫动物，制备抗体。以重组RTB为抗原免疫小鼠获得了8株能够识别天然蓖麻毒素的单克隆抗体，分别是38-3-8，14-1，3-2-7，2-28-5-6，8-1-1-8，13-2-4，7-8-24，9-2。制备小鼠腹水，并利用亲和层析纯化了单克隆抗体。ELISA和Western blot检测抗体能与RTB和Ricin特异性结合。用于ELISA分析抗体配对，，8株抗体均能够识别重组B链毒素和天然毒素；8株抗体之间不能够配对；8株抗体和抗RTA抗体也不能配对。同样方法制备了4株抗RTA单克隆抗体：1-1,13-4,4-2-15-4,2-07。4株抗体均能和Ricin特异性结合，2株抗体(1-1,4-2-15-4)与RTB有较弱的结合，2株抗RTA抗体(13-4，2-07)与RTA结合特异性强，抗体13-4，2-07可以用于建立糖基蛋白-Ricin-单克隆抗体-HRP标记羊抗鼠抗体的夹心ELISA方法。 由以上结果得出如下结论：成功制备了RTA和RTB重组蛋白，以重组蛋白为抗原制备了单克隆抗体，得到了8株抗RTB、4株抗RTA抗体，ELISA和Western blot测定了它们的抗原特异性。其中抗体13-4,2-07可用于建立的糖基蛋白-Ricin-单克隆抗体-HRP标记羊抗鼠抗体的夹心ELISA方法，用于Ricin的特异性检测。 蓖麻毒素的B链是帮助A链进入细胞膜的，本身没有毒性，可以用已经获得针对B链的抗体，对蓖麻毒素的结构、性质和作用机理进行研究。将所有针对A链和B链的抗体进行配对分析，并在分析的结果之上，进行ELISA验证，希望能找到配对的抗体，组装成试剂盒，用于蓖麻毒素的定性和定量检测。最后还将对获得的针对A链的抗体进行功能研究，看是否有抗体具有中和活性，将具有中和活性的抗体人源化，将来或可以用于蓖麻毒素中毒的急性期的救治。
【关键词】：蓖麻毒素 单克隆抗体 酶联免疫分析
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英文缩写表9-13
• 1 引言13-20
• 1.1 蓖麻毒素的结构、毒性作用机理13-14
• 1.2 蓖麻毒素生物恐怖及其医学防护救治14-16
• 1.3 蓖麻毒素抗体最有可能成为蓖麻毒素中毒急救特效药16-17
• 1.4 蓖麻毒素国内外研究进展及展望17-20
• 2 蓖麻毒素 B 链蛋白的制备20-35
• 2.1 实验材料20-23
• 2.1.1 菌株、质粒及其它生化试剂20
• 2.1.2 实验仪器20-21
• 2.1.3 溶液与培养基21-23
• 2.2 实验方法23-27
• 2.2.1 蛋白的制备23-25
• 2.2.2 重组质粒验证25
• 2.2.3 蛋白质纯化25-26
• 2.2.4 肽质量指纹谱测定26
• 2.2.5 Bradford 法测定表达蛋白的浓度26-27
• 2.3 实验结果27-32
• 2.3.1 质粒基因验证结果27
• 2.3.2 抗原(IPTG 诱导)表达27-28
• 2.3.3 蓖麻毒素 B 链蛋白的纯化28-29
• 2.3.4 肽质量指纹谱测定29-31
• 2.3.5 Bradford 法对浓度的测定31-32
• 2.4 讨论32-35
• 3 蓖麻毒素 B 链抗体的制备35-63
• 3.1 实验设备及材料35-40
• 3.1.1 主要仪器设备35-36
• 3.1.2 实验材料36-40
• 3.2 实验方法40-53
• 3.2.1 动物免疫40-42
• 3.2.2 小鼠实体瘤制备42
• 3.2.3 细胞融合42-44
• 3.2.4 细胞筛选44-45
• 3.2.5 细胞克隆化45-47
• 3.2.6 阳性细胞株冻存与复苏47
• 3.2.7 大量制备抗体47-49
• 3.2.8 IgG SDS-PAGE49-51
• 3.2.9 抗体定性检测51-53
• 3.3 配对研究53
• 3.4 实验结果53-60
• 3.5 讨论60-63
• 4 蓖麻毒素 A 链抗体的制备63-76
• 4.1 实验设备及材料63-68
• 4.1.1 主要实验仪器设备63-64
• 4.1.2 实验材料64-68
• 4.2 实验方法68-72
• 4.2.1 动物免疫68-70
• 4.2.2 小鼠实体瘤制备70
• 4.2.3 细胞融合70-71
• 4.2.4 细胞筛选71
• 4.2.5 抗体纯化及效价的测定71-72
• 4.3 实验结果72-73
• 4.4 讨论73-76
• 5 单克隆抗体抗原特异性及应用76-87
• 5.1 实验设备及材料76-80
• 5.1.1 主要仪器设备76-77
• 5.1.2 实验材料77-80
• 5.2 实验方法80-81
• 5.2.1 ELISA 测定80
• 5.2.2 糖蛋白 ASF-Ricin-单抗-HRP 标记羊抗鼠方法检测 Ricin80-81
• 5.3 实验结果81-85
• 5.3.1 单克隆抗体的抗原特异性分析81-85
• 5.4 讨论85-87
• 6 结论87-88
• 参考文献88-93
• 作者简介及在学期间取得的科研成果93-94
• 致谢94

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 崔志英,江青艳;蓖麻饼粕的饲用[J];广东饲料;2003年06期

2 郎立伟;王玉霞;王晨宇;赵宇;贾培媛;傅风华;;双抗体夹心酶联免疫法检测不同样品中的蓖麻毒素[J];国际药学研究杂志;2009年01期

3 张力,吴玉章;人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的研制[J];免疫学杂志;2005年04期

4 王晨宇;郎立伟;钟玉环;王玉霞;贾培媛;武军华;李桦;;生物样品中蓖麻毒素的双夹心酶联免疫定量检测方法及应用[J];军事医学;2011年08期

5 罗军荣;斯日古楞;刘霄卉;周建华;马学恩;;JSRV衣壳蛋白单克隆抗体的制备及免疫学鉴定[J];生物化学与生物物理进展;2009年01期

6 胡晓倩;陈来同;赵健;;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法[J];中国生化药物杂志;2011年02期

7 陈光;单克隆抗体技术历史与发展简述[J];生物学通报;2003年09期

8 周志军;施金荣;朱华松;王平;余模松;;乙型脑炎病毒SA14-14-2株和P3株单克隆抗体的制备及应用[J];中国生物制品学杂志;2012年04期

9 詹金彪;周佩珩;;蓖麻毒素与肿瘤导向治疗[J];实用肿瘤杂志;1989年01期

10 董炜疆,胡海涛,冯改丰,杨广笑,王全颖;β淀粉样肽1～42单克隆抗体的制备[J];西安交通大学学报(医学版);2004年05期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 沈庆丰;抗软骨藻酸单克隆抗体制备及ELISA检测方法建立[D];吉林大学;2008年

2 谢松丽;肝癌细胞膜蛋白单克隆抗体的筛选与制备[D];重庆医科大学;2009年

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本文编号：485305