自噬及内质网应激在内皮细胞管型形成中的作用

发布时间：2017-06-27 18:03

  本文关键词：自噬及内质网应激在内皮细胞管型形成中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：利用新生血管恢复缺血组织血液供应以减少心肌损伤,恢复心功能,是治疗缺血性心脏病的重要措施之一。大量研究表明,自噬和内质网应激具有心肌保护和促细胞分化作用。同时,有报道表明白噬参与缺氧诱导的血管新生过程。然而重要的血管生成诱导因子血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)介导的血管新生是否与自噬和内质网应激有关并不清楚。本研究旨在探讨自噬及内质网应激在VEGF介导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)管型形成中的作用。为以内质网应激和自噬为靶点的血管生成调控药物的研发奠定相关理论和实验基础。 方法：以不同浓度和时间VEGF处理培养的HUVEC为模型,采用二氢罗丹明(Dihydrorhodamine123, DHR123)染色分析活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生,采用免疫印迹、RT-PCR技术检测自噬及内质网应激标志物蛋白水平及mRNA水平表达,采用Matrigel分析内皮细胞管型形成能力以及细胞划痕实验分析细胞迁移能力。同时采用内质网应激抑制物、自噬抑制物以及白噬相关标志物基因沉默技术观察内质网应激和自噬程度下调后对管型形成的影响。以小鼠左冠状动脉前降支结扎为心肌缺血模型,采用Western blot检测血管生成及自噬相关蛋白表达水平,免疫组织化学分析血管生成标志物的表达情况。 结果：DHR123染色定量分析显示VEGF促进HUVEC中ROS产生,且呈现一定的浓度和时间依赖性关系。同时,RT-PCR和免疫印迹分析显示：VEGF促进内质网应激相关基因肌糖需求酶-1(Inositol requiring enzyme1, IRE-1),葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein, GRP78/Bip),自噬相关基因4(autophagy-related gene4, ATG4),自噬相关基因5(autophagy-related gene5, ATG5), Beclin-1(autophagy-related gene6, ATG6/Beclin-1) mRNA及蛋白表达,并在一定程度上呈现浓度及时间依赖性。利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)及Beclin-1特异性siRNA阻断白噬发生后能显著抑制(?)100ng/ml VEGF介导的HUVEC管型形成,降低细胞迁移能力。而且阻断自噬发生,并不影响内质网应激的发生,其相应的标志物(IRE-1,Bip)仍处于高表达状态。利用牛磺熊去氧胆酸钠(Tauroursodeoxycholic acid sodium salt, TUDC)阻断内质网应激,也同样可以抑制(?)VEGF介导的HUVEC形成管型的能力和细胞迁移能力,同时也抑制了自噬发生,其相应标志物LC3-Ⅱ及Beclin-1的表达下降。整体动物实验结果显示,心肌缺血15天后小鼠心脏组织血管生成标志物血管内皮钙粘蛋白(vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin)表达增多,同时自噬相关蛋白LC3表达也增多。 结论：1.整体动物水平显示,缺血后血管生成与LC3-Π表达呈同向变化。2.细胞水平显示VEGF通过诱导ROS生成,引发内质网应激和自噬,进而促进HUVEC管型形成。
【关键词】：血管内皮生长因子 人脐静脉内皮细胞 自噬 内质网应激 管型形成
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目录9-11
• 符号说明11-12
• 1 前言12-15
• 2 材料与方法15-22
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1. 细胞15
• 2.1.2 实验动物15
• 2.1.3 主要试剂及抗体15
• 2.1.4 主要仪器设备15-16
• 2.1.5 引物序列16-17
• 2.2 方法17-22
• 2.2.1 脐静脉内皮细胞的培养17
• 2.2.2 细胞总RNA提取17
• 2.2.3 RT-PCR17-18
• 2.2.4 细胞总蛋白样品的制备18
• 2.2.5 免疫印记分析(Western blot)18
• 2.2.6 脂质体介导的瞬时转染18
• 2.2.7 划痕实验18-19
• 2.2.8 Matrigel实验19
• 2.2.9 ROS定量分析19
• 2.2.10 实验动物饲养与分组19-20
• 2.2.11 小鼠心肌缺血模型制备20
• 2.2.12 心肌组织蛋白提取20
• 2.2.13 切片制备及免疫组织化学20-21
• 2.2.14 统计分析21-22
• 3 实验结果22-39
• 3.1 VEGF诱导内皮细胞自噬22-25
• 3.1.1 Western blot检测不同时间VEGF诱导的自噬标志蛋白表达22-23
• 3.1.2 Western blot检测不同浓度VEGF诱导的自噬标志蛋白表达23-24
• 3.1.3 RT-PCR检测不同时间VEGF诱导的自噬相关基因mRNA表达24
• 3.1.4 RT-PCR检测不同浓度VEGF诱导的自噬相关基因mRNA表达情况24-25
• 3.2 VEGF诱导的内皮细胞活性氧生成25-27
• 3.2.1 不同时间VEGF诱导的ROS产生25-26
• 3.2.2 不同浓度VEGF诱导的活性氧ROS产生26-27
• 3.3 VEGF激发内皮细胞内质网应激27-30
• 3.3.1 Western blot检测不同浓度VEGF诱导的内质网应激标志蛋白表达27-28
• 3.3.2 Western blot检测不同时间VEGF诱导的内质网应激标志蛋白表达28-29
• 3.3.3 RT-PCR检测不同浓度VEGF诱导的内质网应激相关基因mRNA表达29
• 3.3.4 RT-PCR检测不同时间VEGF诱导的内质网应激相关基因mRNA表达29-30
• 3.4 自噬阻断对HUVEC管型形成能力的影响30-33
• 3.4.1 Western blot检测自噬阻断对VEGF诱导的自噬及内质网应激的影响30-31
• 3.4.2 划痕实验检测抑制自噬对VEGF诱导的HUVEC迁移的影响31-32
• 3.4.3 基质胶实验检测抑制自噬对VEGF诱导的HUVEC管型形成的影响32-33
• 3.5 内质网应激在VEGF诱导的管型形成中的作用33-36
• 3.5.1 Western blot检测抑制内质网应激对VEGF诱导的自噬及内质网应激的影响33-34
• 3.5.2 划痕实验检测抑制内质网应激对VEGF诱导的HUVEC迁移力的影响34-35
• 3.5.3 基质胶实验检测抑制内质网应激对VEGF诱导的HUVEC管型形成能力的影响35-36
• 3.6 小鼠心肌缺血对血管生成与自噬的影响36-39
• 3.6.1 Western blot检测小鼠心肌缺血对血管生成及自噬的影响36-37
• 3.6.2 免疫组织化学检测小鼠心肌缺血对血管形成的影响37-39
• 4 讨论39-41
• 5 结论41-42
• 参考文献42-45
• 综述45-56
• 参考文献52-56
• 攻读学位期间主要研究成果56-57
• 致谢57

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 孙大军,杨淑华,李亚萍,杜建时,祁功才;利用重组人VEGF165制备单克隆抗体的研究[J];白求恩医科大学学报;2001年05期

2 崔凤东,吴孟超,喻德洪,磨伊正羲;抗血管新生疗法治疗大肠癌肝转移[J];大肠肛门病外科杂志;2001年03期

3 刘鹤南;陈晓隆;;血管紧张素Ⅱ和血管内皮生长因子在视网膜新生血管中的表达及意义[J];国际眼科杂志;2010年08期

4 李迅;刘鹤南;陈晓隆;;血管紧张素转换酶抑制剂抑制小鼠视网膜新生血管的实验研究[J];国际眼科杂志;2011年01期

5 张小波;邓东;;肺癌肿瘤血管生成与CT灌注成像的相关性研究[J];广西医学;2006年07期

6 丁剑波;张佳莹;李秀惠;;细胞自噬在急性肝损伤中的变化及作用[J];中国肝脏病杂志(电子版);2013年03期

7 Jun Cheng;Min Quan;Liang Wu;Qi Wang;;The Role of Autophagy in Hepatitis C Virus Infection[J];Infection International(Electronic Edition);2012年01期

8 刘嘉璐,顾谦群,方玉春;软骨抗癌活性成分的研究进展[J];中国海洋药物;1999年01期

9 曹阳;程萱;王剑;范雄伟;杨晓;;心肌细胞特异性Let-7b转基因小鼠的建立[J];军事医学;2011年06期

10 魏辉;曾秋棠;;血清血管内皮生长因子浓度在冠心病诊断和介入治疗中的临床意义[J];临床心血管病杂志;2007年11期

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 聂李亚;重组人肝细胞生长因子裸质粒生产工艺研究[D];天津大学;2011年

2 赵明光;血管内皮细胞生长因子、Tie受体和血管生成素在人脑动静脉畸形血管内皮细胞中的表达及缺氧对其诱导作用的研究[D];天津医科大学;2002年

3 刘岘;应用二步法预定位技术对荷人肝癌裸鼠模型进行MR免疫成像的实验研究[D];第一军医大学;2004年

4 孙勇新;自体骨髓单个核细胞移植对心肌梗死后心脏功能的影响及血管生成相关基因的调节[D];复旦大学;2004年

5 宋振全;慢性低灌注压下脑微循环动态变化、VEGF表达及BBB通秀性改变[D];第四军医大学;2005年

6 王守立;TGF-β1反义寡核苷酸对人横纹肌肉瘤细胞生长分化的影响[D];四川大学;2004年

7 李勇;Endostatin和Angiostatin两种基因联合碘油对大鼠肝癌的抑制效果及其机制的研究[D];吉林大学;2006年

8 张锋;气管移植的实验研究[D];中国协和医科大学;2002年

9 张菊;肿瘤血管生长抑制因子Angiostatin基因的克隆及表达[D];第四军医大学;1998年

10 张从纪;VEGF在涎腺中转基因表达及对口内创伤愈合影响的实验研究[D];第四军医大学;2000年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 宋志远;Fascin和MVD的表达与垂体腺瘤侵袭性的关系[D];山西医科大学;2011年

2 丛璐璐;趋化因子受体CXCR4在神经胶质瘤中的表达及意义[D];河北医科大学;2011年

3 陈艳波;蝙蝠葛酚性碱对S180荷瘤小鼠COX-2及VEGF表达的影响[D];黑龙江中医药大学;2011年

4 单书繁;Bax和VEGF在子宫内膜癌中的表达及意义[D];大连医科大学;2011年

5 孙璐;冠状动脉粥样硬化斑块内血管新生及其与斑块稳定的关系[D];军医进修学院;2001年

6 郭晓静;VEGF及其Flk-1、Flt-1和nm23-H_1的表达与肝细胞癌血管生成、生长和转移的关系[D];天津医科大学;2002年

7 遇红;子宫内膜癌中VEGF及其受体KDR的表达及临床意义[D];青岛大学;2002年

8 鲁照明;人尿血管抑素测定及其临床应用[D];郑州大学;2002年

9 王革芳;反应停调控肺癌细胞株诱导血管形成机制研究[D];第二军医大学;2002年

10 刘亮;活化巨噬细胞对血管内皮细胞生物学特性及成血管作用的影响[D];第三军医大学;2003年

  本文关键词：自噬及内质网应激在内皮细胞管型形成中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：490694