人CD133基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制

发布时间：2017-06-27 18:10

  本文关键词：人CD133基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：CD133是一种局限性分布于胞浆膜突出处的5次跨膜糖蛋白，1997年由Yin等首次报道，2000年6月由国际白细胞分化抗原工作组会议（ILDAW）正式命名为CD133。近年来研究发现人CD133分子是分离和鉴定多种干细胞（尤其是肿瘤干细胞）的表面标记分子，也有研究表明CD133+肿瘤细胞具有很强的增殖、自我更新和多向分化的潜能，对于CD133分子生物学特征和功能的研究有助于对肿瘤干细胞特征和功能的认识，同时在肿瘤的诊断治疗以及预后判断方面具有重要价值，有望成为肿瘤治疗的靶点。 虽然CD133分子从1997年发现以来一直被广大科研工作者关注，但迄今为止，由于与其相作用的配体分子仍然未知，对CD133分子尚缺乏有效的研究手段，CD133的生物学功能以及其参与的信号通路至今尚需要进一步研究阐明。目前商品化的CD133抗体（W6C3B1, AC133, AC141, Miltenyi Biotec）由于主要是识别该分子的糖基化位点，在运用中有一定的局限性。鉴此，研制新型特异性抗人CD133单克隆抗体将有助于拓展对CD133分子的研究，揭示CD133的生物学功能以及该分子在肿瘤发生发展中作用机制，不仅在理论研究中具有重要意义，而且在临床应用中也具有重要的潜在价值。 本论文旨在通过构建稳定表达人CD133分子的L929基因转染细胞株，以L929/CD133和天然高表达CD133的结肠癌细胞株HCT116为免疫原，常规免疫BALB/c小鼠，研制鼠抗人CD133单克隆抗体，初步探讨CD133分子的生物学特性，近而为研究该分子在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。 第一部分人CD133基因转染细胞株的建立 【目的】构建稳定表达人CD133分子的L929/CD133基因转染细胞株，为研制鼠抗人CD133单克隆抗体提供免疫原和阳性筛选细胞。 【方法】将CD133全长基因双酶切后重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term。通过脂质体转染技术将测序正确的重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD133和两个辅助病毒载体pHIT456和pHIT60共转染包装细胞293T；48h和72h后分别收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞；72h后，用Zeocin进行加压，通过流式细胞术检测筛选获得稳定表达CD133分子的L929/CD133基因转染细胞。 【结果】成功构建稳定表达人CD133的基因转染细胞株L929/CD133。 【结论】本研究成功构建了稳定表达人CD133的基因转染细胞株，为研制鼠抗人CD133单克隆抗体和研究CD133生物学功能奠定了基础。 第二部分鼠抗人CD133单克隆抗体的研制 【目的】研制鼠抗人CD133单克隆抗体，探讨该单抗的生物学特性，为进一步研究人CD133分子的功能奠定物质基础。 【方法】以稳定表达人CD133的基因转染细胞株L929/CD133和天然高表达CD133的结肠癌细胞株HCT116为免疫原，免疫6~8周龄的BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞Ag8进行细胞融合，并于HAT选择性培养基中培养；以L929/CD133作为阳性筛选细胞株，并以转染pEGZ-Term空载体的L929/mock细胞株作为阴性对照，采用流式细胞术对杂交瘤细胞进行筛选；对所得阳性杂交瘤细胞进行多次克隆化培养，获得1株持续稳定分泌特异性鼠抗人CD133单克隆抗体的杂交瘤细胞株；利用细胞核染色技术、Ig亚型快速定性试纸法、细胞免疫化学法等试验，对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行生物学特性的鉴定；采用间接免疫荧光法检测分析所获单抗对不同肿瘤细胞株和肿瘤组织上CD133分子的识别。 【结果】获得l株稳定持续分泌鼠抗人CD133单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为18E5。经体外连续培养半年以上，液氮冻存后复苏，细胞的生长状态良好，分泌抗体的性能稳定。经快速定性试纸分析鉴定，18E5的重链为IgG2b，轻链为κ链；单抗识别位点竞争实验结果表明18E5与商品化单抗AC133和AC141识别表位不同，腹水形成阳性率为100%，腹水的收获量平均为4ml/只。间接免疫荧光分析结果显示：单抗18E5能够特异性识别人CD133分子，并且能够识别人白血病细胞株U937、肺癌细胞株A549、NCI-H1299，，结肠癌细胞株SW480、Caco-2、HCT116以及胰腺癌细胞株Patu-8988表面CD133分子的表达，也可识别肺癌和结肠癌标本中CD133分子的表达。 【结论】成功获得l株稳定持续分泌鼠抗人CD133单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体和商品化单抗AC133和AC141识别不同的抗原表位，可以运用于流式细胞术和免疫组化检测分析。
【关键词】：人 CD133 基因转染 单克隆抗体
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 研究背景11-22
• 参考文献17-22
• 第一部分 人 CD133 基因转染细胞株的建立22-31
• 参考文献29-31
• 第二部分 鼠抗人 CD133 单克隆抗体的研制31-49
• 参考文献47-49
• 总结与展望49-50
• 附件50-62
• 参考文献60-62
• 攻读硕士学位期间发表的论文62-63
• 本研究所获的基金资助63-64
• 缩略词表64-66
• 致谢66-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 袁晓俊;贺其图;;Notch信号通路在白血病发生及血管新生中的作用[J];中国实验血液学杂志;2010年02期

  本文关键词：人CD133基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：490738