DNA疫苗pSVK-CAVA宿主菌的筛选及其发酵培养基的优化

发布时间：2017-06-27 22:07

  本文关键词：DNA疫苗pSVK-CAVA宿主菌的筛选及其发酵培养基的优化，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一章DNA疫苗pSVK-CAVA高稳定性宿主菌的筛选与鉴定 目的：从多种不同基因型的大肠杆菌中筛选出适合本研究大分子质粒DNA疫苗的宿主菌,并建立三级种子库。 方法：将质粒pSVK-CAVA (14.7kb)转化4种大肠杆菌化学感受态细胞并提取质粒,通过琼脂糖凝胶电泳实验检测质粒的形态结构。对基因工程菌进行生化检测,并通过连续传代法和酶切鉴定进行稳定性检测,同时将质粒DNA瞬时转染至293T细胞中检测质粒表达能力。选取质粒含量最高和稳定性最好的工程菌作为原始种子分装冻存,将原始种子库扩大培养,逐级建立好主种子库和工作种子库,即三级种子库。 结果：确定了XL10-Gold作为质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌,基因工程菌传代稳定性和结构稳定性良好,工程菌生化特性未发生改变,质粒能在293T细胞中体外表达,成功建立了达到中试要求的三级种子库。 结论：大肠杆菌XL10-Gold适合作为质粒DNA疫苗的宿主菌,解决了大质粒在常用宿主菌中不稳定的难题。 第二章响应面法优化质粒DNA疫苗工程菌发酵培养基 目的：筛选出基础培养基,并利用统计学方法对肿瘤疫苗工程菌发酵培养基进行优化,提高质粒DNA产量,降低成本。 方法：通过摇瓶试验,利用单因素法对几种备选基础培养基进行筛选,之后应用Plackett-Burman试验设计方法和响应面法,对初始培养基7种组分配比进行优化；利用Minitab软件对实验数据进行多元回归分析,并建立3种主要因素与质粒DNA产量之间的函数关系。将最终优化的配方进行3次重复验证实验。 结果：筛选出TB培养基为基础培养基,质粒容积产量达到9.9mg/L,比LB培养基提高了接近1倍。培养基3种主要因素的最佳浓度为：酵母提取物16.61g/L,甘油3.05ml/L,硫酸镁0.185g/L,质粒DNA产量能达到12.38mg/L。3次验证实验所测得的质粒DNA产量平均能达到12.28mg/L,与预测结果基本一致。 结论：利用响应面法对肿瘤疫苗工程菌发酵培养基优化可以显著提高疫苗质粒DNA产量。
【关键词】：质粒DNA 宿主菌 培养基 响应面法
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目录8-10
• 缩略词表10-11
• 1 前言11-13
• 2 DNA疫苗pSVK-CAVA高稳定性宿主菌的筛选与鉴定13-27
• 2.1 实验材料13-16
• 2.1.1 质粒13
• 2.1.2 菌种13
• 2.1.3 细胞13-14
• 2.1.4 酶及主要试剂14-15
• 2.1.5 主要仪器设备15
• 2.1.6 主要溶液及配置15-16
• 2.2 实验方法16-22
• 2.2.1 用氯化钙制备感受态细胞16-17
• 2.2.2 转化感受态细胞17
• 2.2.3 质粒小提17
• 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳17-18
• 2.2.5 紫外分光光度计测OD值18
• 2.2.6 菌种培养条件18
• 2.2.7 宿主菌生长状态和质粒质量监测方法18
• 2.2.8 原始种子库的建立18
• 2.2.9 主种子库的建立18-19
• 2.2.10 工作种子库的建立19
• 2.2.11 工作种子库稳定性检测19
• 2.2.12 工程菌形态和革兰氏染色特征检测19-20
• 2.2.13 工程菌生化特征检测20
• 2.2.14 质粒pSVK-CAVA大小和酶切鉴定20
• 2.2.15 工作种子库质粒大量提取20-21
• 2.2.16 通过Invitrogen公司的Lipofectamine 2000试剂将大提的质粒pSVK-CAVA转染至293T细胞21
• 2.2.17 免疫荧光检测质粒pSVK-CAVA表达21-22
• 2.2.18 工程菌传代稳定性检测22
• 2.3 结果22-25
• 2.3.1 宿主菌筛选22-23
• 2.3.2 三级种子库的建立及工作种子库的稳定性检测23-25
• 2.3.3 细菌形态和革兰氏染色特征及其生化特征25
• 2.4 讨论25-27
• 3 工程菌E.coli CAVA发酵培养基的优化27-44
• 3.1 实验材料27-31
• 3.1.1 菌种27
• 3.1.2 主要试剂27-28
• 3.1.3 主要溶液及配置28-30
• 3.1.4 主要仪器30-31
• 3.2 实验方法31-32
• 3.2.1 基础培养基的筛选31
• 3.2.2 单因素试验确定最佳氮源和碳源31
• 3.2.3 Plackett-Burman(PB)设计筛选影响质粒摇瓶发酵的显著因素31-32
• 3.2.4 最陡爬坡法实验32
• 3.2.5 响应面法确定显著影响因素的最佳取值32
• 3.3 结果32-42
• 3.3.1 基础培养基的筛选32-34
• 3.3.2 不同碳源对质粒产量的影响34
• 3.3.3 不同氮源对质粒产量的影响34
• 3.3.4 Plackett-Burman设计筛选影响质粒摇瓶发酵的显著因素34-37
• 3.3.5 最陡爬坡法确定响应面因素水平的中心点37
• 3.3.6 中心复合设计(Center Composite Design；CCD)37-39
• 3.3.7 二次回归拟合及方差分析39-40
• 3.3.8 显著因素水平的优化40-42
• 3.4 讨论42-44
• 5 结论44-45
• 参考文献45-47
• 综述47-54
• 参考文献52-54
• 攻读学位期间主要的研究成果目录54-55
• 致谢55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张亮;阎瑾琦;王越;肖毅;高昆;董金凯;王博;于继云;;可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达[J];南方医科大学学报;2011年06期

2 代志凯;张翠;阮征;;试验设计和优化及其在发酵培养基优化中的应用[J];微生物学通报;2010年06期

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本文编号：491400