TLR信号在呼吸道合胞病毒疫苗增强性免疫病理中的作用

发布时间：2017-07-01 13:04

  本文关键词：TLR信号在呼吸道合胞病毒疫苗增强性免疫病理中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的最重要病原体,接种疫苗是重要的预防措施,福尔马林灭活疫苗(RSV)因其疫苗增强性免疫病理(VEP)成为呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗成功研制的主要障碍。已知TLR激动剂作为佐剂可以调节疫苗诱导的免疫应答类型。本研究选用三种TLR激动剂(分别为TLR-9配体CpG2216,TLR-2配体PamCys3和TLR-3配体poly(I:C))作为佐剂,同时采用MyD88~(-/-)小鼠,观察TLR信号增强或抑制后受到RSV攻击的小鼠肺组织免疫病理的变化,进而研究TLR信号在呼吸道合胞病毒疫苗增强性免疫病理中的作用。方法:1培养细胞来源RSV病毒,并测其病毒滴度。2制备福尔马林灭活疫苗FI-RSV及对照组疫苗FI-C。3分别用FI-C,FI-RSV,FI-RSV+CpG2216,FI-RSV+PamCys3,FI-RSV+poly(I:C)免疫C57BL/6野生型小鼠,用FI-RSV免疫MyD88~(-/-)C57BL/6小鼠,共免疫三次,正常对照组不免疫。4用ELISA方法测末次免疫后血清抗体IgG,观察不同组对体液免疫的影响。5末次免疫28天后用RSV鼻腔感染小鼠,正常对照组不感染,观察感染前至感染后5天的体重变化。6感染第5天,处死小鼠,取小鼠肺组织及肺组织匀浆上清,用实时定量PCR检测肺组织中RSV病毒N基因(RSV-N),考察病毒在小鼠体内的复制情况;ELISA测肺匀浆上清中细胞因子IL-4,IL-6,IL-12,IL-17,TNF-α,IFN-γ的含量;考察感染后Th1和Th2应答是否平衡以及肺部炎症反映情况;肺部组织切片经HE染色,观察炎症浸润和组织损伤情况;PAS(periodic acid Schiff)染色,观察气道粘液分泌情况。结果:1成功培养出RSV,并测定病毒滴度为10~(73) pfu/ml。2成功制备福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)和对照组疫苗(FI-C)。3 ELISA检测血清IgG结果:与正常对照组、FI-C对照组比较,各疫苗免疫组均诱导了产生IgG抗体,有显著性差异(P0.05),各组间IgG水平无显著性差异(P0.05)。说明单独疫苗与佐剂+疫苗在诱导IgG方面的效果是相似的。4体重变化情况:与正常对照组相比,各组均有显著性的体重减轻,各组之间无显著性差异。肺组织染色5.1 HE染色的肺组织切片显示:正常对照组,肺泡壁结构完整,无水肿,无明显炎性细胞浸润;与FI-RSV组相比,FI-RSV+CpG2216组、FI-RSV+PamCys3组经RSV攻击后肺部的炎症反应明显增强,均有大量的炎症细胞浸润,肺泡壁明显增厚,肺泡间出现融合和水肿,偶见出血点,而FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV MyD88~(-/-)C57BL/6组肺部的炎症反应较FI-RSV组明显减轻。5.2 PAS染色的肺组织切片显示:正常对照组没有或仅有少量的粘液分泌,FI-control、FI-RSV组、FI-RSV+CpG2216组、FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV MyD88~(-/-)C57BL/6组经RSV攻击后出现不同程度的粘液增加,FI-RSV+PamCys3组粘液分泌显著高于FI-RSV组,FI-RSV+CpG2216组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV MyD88~(-/-)C57BL/6组粘液分泌显著低于FI-RSV组。6实时定量PCR检测RSV-N结果显示:FI-C组明显被RSV感染,其他各组都得到一定的保护作用,且佐剂组和FI-RSV MyD88~(-/-)C57BL/6组的保护效果显著优于FI-RSV野生组(P0.05)7ELISA测肺匀浆液中细胞因子结果显示:FI-RSV+CpG2216组、FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+poly(I:C)组的IL-4、IL-6、IL-12显著低于FI-RSV组(P0.05),FI-RSV MyD88~(-/-)C57BL/6组显著低于FI-RSV组(P0.05);FI-RSV+CpG2216组、FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+poly(I:C)组的TNF-α,IFN-γ显著高于FI-RSV组(P0.05),FI-RSV MyD88~(-/-)C57BL/6组与FI-RSV组无显著差异(P0.05);FI-RSV+PamCys3组和FI-RSVMyD88~(-/-)C57BL/6组的IL-17显著低于其他组。IFN-γ/IL-4显示,FI-RSV+CpG2216组、FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+poly(I:C)组显著低于FI-RSV组(P0.05),FI-RSV+poly(I:C)组显著高于FI-RSV+CpG2216组、FI-RSV+PamCys3组;FI-RSV+CpG2216组、FI-RSV+PamCys3组无显著差异(P0.05);MyD88~(-/-)C57BL/6组与FI-RSV组无显著差异(P0.05)结论:1增强TLR信号或敲除MyD88对FI-RSV诱导的IgG水平无影响。2以TLR激动剂CpG2216或PamCys3作为FI-RSV的佐剂,加重了疫苗增强性免疫病理;而以TLR激动剂poly(I:C)为佐剂或敲除MyD88均减轻了疫苗增强性免疫病理。3TLR信号对呼吸道合胞病毒疫苗增强性免疫病理的影响可能与其调节的Th1、Th2以及Th17型免疫应答有关。
【关键词】：TLR信号 呼吸道合胞病毒 FI-RSV CpG2216 PamCys3 poly(I:C)
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-11
• 材料与方法11-22
• 结果22-25
• 附图25-32
• 讨论32-33
• 结论33-34
• 参考文献34-35
• 综述 Notch对固有免疫和适应性免疫的调节35-45
• 参考文献38-45
• 致谢45-46
• 个人简历46

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