铁载体高产菌的筛选及铁载体的分离纯化

发布时间：2017-07-01 12:22

  本文关键词：铁载体高产菌的筛选及铁载体的分离纯化，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：铁是生命有机体的必需元素,在生物的代谢过程中起着重要作用。在微生物的代谢过程中,铁元素是多种酶的辅基或激活剂,如细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、铁氧还蛋白及铁硫蛋白酶等都需要铁作为活性基。生物缺铁时上述代谢过程均会受到显著的影响。 铁载体(siderophore)是微生物在低铁应激条件下产生的一种能够高效率结合三价铁离子的低分子量(500-1000Da)有机化合物,其生物合成过程受环境中铁离子浓度的严格控制。 本研究采用LB培养基和2216E培养基从青岛近海海鱼的肠道和鱼鳃中共分离纯化出326株细菌。通过CAS固体和液体方法共筛选出52株铁载体高产菌株,铁载体表达量均在50%以上。通过高氯酸铁实验、氯化铁实验、Csaky实验和Arown实验,对所筛选出的52株铁载体高产细菌进行铁载体类型检测,结果显示,能够产生异羟肟酸类铁载体的细菌有30株,能够产生儿茶酚类铁载体的细菌有16株,还有13株菌所产的铁载体类型无法确定,其中有8株菌既能够产生儿茶酚类铁载体又能够产生异羟肟酸类铁载体。其中菌株CB-EH-2为产铁载体的优势菌株,铁载体表达量为83.117%,达到6.299mg/L。 利用16S rDNA序列比对,发现菌株CB-EH-2属于Cobetia marina。通过考察2,2'-联吡啶以及铁离子浓度对菌株CB-EH-2生长和产铁载体的影响,结果显示：1)当2,2’-联吡啶的浓度为50μmol/L时,铁载体产量最高；当2,2’-联吡啶的浓度超过200μmol/L时,菌株不生长,说明微量的2,2,-联吡啶能够刺激菌株CB-EH-2产生铁载体；2)当铁离子的浓度超过10μmol/L时,菌株处于富铁的环境,从而抑制了菌株铁载体的合成,而铁离子浓度的增加对菌体产量影响不大。 采用大孔吸附树脂XAD-2、葡聚糖凝胶色谱(Sephadex HL-20)等方法对菌株CB-EH-2的发酵上清液中的铁载体进行了初步分离纯化,该部分纯化产物能够抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灿烂弧菌4501和鳗弧菌VB1的生长,同时利用高效液相色谱及电喷雾电离子质谱联用(LC-MS)对部分纯化产物进行了测定,实验结果显示该产物中包含两种物质,其中一种为铁载体,另一种为脂肽类物质。
【关键词】：铁载体 CAS检测 海洋细菌 异羟肟酸 儿茶酚
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-11
• 绪论11-29
• 1.1 铁载体的概念11-12
• 1.2 铁载体介导的铁吸收12-17
• 1.2.1 微生物中的铁吸收12
• 1.2.2 微生物从铁载体获取铁的机制12-15
• 1.2.2.1 概述12-13
• 1.2.2.2 Fe~(3+)-铁载体受体13-14
• 1.2.2.3 TonB-EabB-ExbD复合体14
• 1.2.2.4 以E.coli为例说明微生物运输铁的一般机制14-15
• 1.2.3 微生物铁载体-铁的跨膜运输可能有三种机制15-16
• 1.2.4 微生物中的其它铁运输系统16-17
• 1.2.4.1 Feo系统16
• 1.2.4.2 ABC(ATP-binding cassette)系统16-17
• 1.3 铁载体的结构17-19
• 1.4 产铁载体微生物19-20
• 1.5 铁载体的检测方法20-22
• 1.5.1 化学方法20-21
• 1.5.1.1 儿茶酚法(Catechols)20-21
• 1.5.1.2 异羟肟酸类(Hydroxamates)21
• 1.5.1.3 常规CAS法21
• 1.5.2 生物方法21-22
• 1.5.2.1 限铁生长21
• 1.5.2.2 交叉培养法21-22
• 1.5.2.3 外膜蛋白22
• 1.6 铁载体生物学功能22-27
• 1.6.1 纸浆的漂白作用23-24
• 1.6.2 石油烃的生物降解24
• 1.6.3 海洋中铁、碳、氮循环中的作用24
• 1.6.4 铁载体的抗癌、抗病毒、抗氧化作用24-25
• 1.6.5 铁代谢疾病的治疗25-26
• 1.6.6 鱼病的控制26
• 1.6.7 环境修复26-27
• 1.6.8 核燃料回收27
• 1.6.9 铁载体的其它用途27
• 1.7 本课题研究意义及计划方案27-29
• 1.7.1 课题研究意义27-28
• 1.7.2 课题研究的计划方案28-29
• 第二章 铁载体高产海洋细菌的筛选29-49
• 前言29
• 2.1 实验材料29-30
• 2.1.1 实验仪器29-30
• 2.1.2 实验试剂30
• 2.1.3 菌株来源30
• 2.2 实验所需培养基、试剂、缓冲液的配制30-32
• 2.2.1 培养基30-31
• 2.2.1.1 LB培养基31
• 2.2.1.2 2216E培养基31
• 2.2.2 实验所需试剂31-32
• 2.3 样品的制备以及菌株的分离纯化32-34
• 2.3.1 样品的来源32
• 2.3.2 样品的制备32
• 2.3.2.1 海鱼的解剖32
• 2.3.2.2 样品的处理32
• 2.3.2.3 样品的稀释32
• 2.3.3 菌株的分离纯化32-34
• 2.3.3.1 菌株的纯化32-33
• 2.3.3.2 革兰氏染色33-34
• 2.4 铁载体高产海洋菌株的筛选34-35
• 2.4.1 铁载体高产海洋菌株的初筛34-35
• 2.4.1.1 CAS固体平板检测34
• 2.4.1.2 CAS双层平板检测34-35
• 2.4.2 铁载体高产海洋菌株的复筛35
• 2.5 铁载体高产菌株的类型研究35-37
• 2.5.1 高氯酸铁实验35
• 2.5.2 FeCl_3实验35-36
• 2.5.3 Csaky实验36
• 2.5.4 Aronw实验36-37
• 2.6 实验结果与分析37-48
• 2.6.1 菌株的分离纯化37
• 2.6.2 革兰氏染色结果37-38
• 2.6.3 铁载体高产菌株的筛选38-41
• 2.6.4 铁载体的类型检测结果41-48
• 2.6.4.1 高氯酸铁检测结果41-42
• 2.6.4.2 FeCl_3检测42
• 2.6.4.3 Csaky检测42-45
• 2.6.4.4 Aronw检测45-46
• 2.6.4.5 不同检测方法的分析46-48
• 2.7 本章小结48-49
• 第三章 产铁载体优势菌株CB-EH-2的鉴定及特性研究49-61
• 前言49
• 3.1 实验材料49-51
• 3.1.1 实验仪器49
• 3.1.2 实验试剂49-50
• 3.1.3 菌株来源50
• 3.1.4 培养基50-51
• 3.1.5 实验所需配制的试剂51
• 3.2 菌株CB-EH-2的鉴定51-53
• 3.2.1 菌株CB-EH-2基因组DNA的提取51-52
• 3.2.2 电泳检测提取DNA52
• 3.2.3 配制PCR所需体系52-53
• 3.2.4 PCR扩增53
• 3.2.5 PCR扩增产物电泳检测53
• 3.3 菌株CB-EH-2的特性研究53-54
• 3.3.1 不同培养基对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响53-54
• 3.3.2 2,2’—联吡啶对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响54
• 3.3.3 不同铁离子浓度对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响54
• 3.4 实验结果及讨论54-60
• 3.4.1 CB-EH-2的鉴定54-55
• 3.4.1.1 CB-EH-2的PCR扩增产物电泳图54
• 3.4.1.2 CB-EH-2的系统发育树54-55
• 3.4.2 菌株CB-EH-2的特性研究55-60
• 3.4.2.1 不同培养基对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响55-56
• 3.4.2.2 2,2’—联吡啶对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响56-58
• 3.4.2.3 铁离子浓度对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响58-60
• 3.5 本章小结60-61
• 第四章 高产铁载体菌株的分离纯化及产物的性质研究61-71
• 前言61
• 4.1 实验材料61-62
• 4.1.1 实验仪器61-62
• 4.1.2 实验试剂62
• 4.1.3 菌株来源62
• 4.1.4 实验所需培养基和所需配制的试剂62
• 4.1.4.1 所需培养基62
• 4.1.4.2 所需配制的试剂62
• 4.2 铁载体的分离纯化62-65
• 4.2.1 产铁载体菌株的发酵62-63
• 4.2.2 发酵上清液的吸附63
• 4.2.3 有机溶剂洗脱、浓缩63
• 4.2.4 浓缩样品的抑菌性研究63
• 4.2.5 Sephadex LH-20进一步洗脱样品63
• 4.2.6 高效液相色谱对产物进行检测63
• 4.2.7 样品Ⅱ的特性研究63-64
• 4.2.8 电喷雾一液/质联用(ESI-LC/MS)对样品进行结构推测64-65
• 4.3 实验结果分析与讨论65-70
• 4.3.1 浓缩液的抑菌活性研究65-66
• 4.3.2 样品Ⅰ、Ⅱ的高效液相检测66-67
• 4.3.3 样品Ⅱ的特性研究67-68
• 4.3.4 电喷雾—液/质联用(ESI-LC/MS)检测结果68-70
• 4.4 本章小结70-71
• 结论71-72
• 参考文献72-76
• 附录76-78
• 致谢78-79
• 攻读学位期间发表的学术论文及申请专利目录79-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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  本文关键词：铁载体高产菌的筛选及铁载体的分离纯化，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：505937