乙肝可复制型DNA疫苗低电压电穿孔递送与免疫活性研究

发布时间：2017-07-02 02:04

  本文关键词：乙肝可复制型DNA疫苗低电压电穿孔递送与免疫活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：DNA疫苗在治疗性疫苗研究领域的地位至关重要。关于DNA疫苗体内递送的研究发展很快，从最初的直接注射到基因枪接种，再发展到新近出现的电穿孔技术，质粒DNA的体内递送效率显著提高，这为DNA疫苗快速发展和应用提供了有力的技术支持。其中电穿孔递送兼备高效、安全、操作简便和低成本等多项特质，成为DNA疫苗递送的首选方案，但关于电穿孔递送条件的深入研究目前还有待进步完善。 当前文献报道电穿孔递送DNA疫苗的常用脉冲电压多集中在180v-900v的高压区。在实际应用中我们发现高电压递送DNA疫苗质粒，会对组织细胞造成定损伤；随着免疫接种次数的增多，DNA疫苗在局部坏死组织的体内递送量也会逐渐降低；而且临床试验时，患者对高电压也会产生定恐惧不利于DNA疫苗的推广应用；所以本研究拟进步探讨低电压下递送DNA疫苗的可行性。 首先，本研究选取携带萤火虫荧光素酶报告基因的三种不同类型表达质粒，作为我们研究体内电穿孔递送的模式质粒。它们分别是：①pGL3-CMV，为本室前期保存，带有萤火虫荧光素酶报告基因的完整表达框，分子量约为5kb，可以作为小分子量质粒的代表；②pEE14.1-luc，为本研究自主构建，由于基础载体分子量较大约为11kb，该质粒构建成功后分子量可达12.5kb，可以作为大分子量质粒的代表；③pSVK-luc，也是本研究自主构建的表达质粒，载体pSVK是基于塞姆利基森林病毒Semliki Forestvirus (SFV)改构而成的可复制型表达载体，其表达特性与传统DNA质粒有显著不同，该质粒分子量约为13kb，可以作为复制子DNA疫苗质粒的代表。重组质粒pEE14.1-luc和pSVK-luc的构建，以质粒pGL3-CMV为模板扩增荧光素酶报告基因，然后克隆入pEE14.1和pSVK载体中构建而成，并采用Western blot、流式细胞术，免疫荧光和活体成像技术检测重组质粒在体内外的表达情况。结果显示重组质粒pEE14.1-luc和pSVK-luc在体内外均获得高效表达。 其次，将pGL3-CMV、pEE14.1-luc和pSVK-luc作为模式质粒，以1μg和50μg两个剂量分别接种BALB/c小鼠左右腿部肌肉，再在低电压范围内选取30V、60V和120V三个脉冲电压进行刺激，接种后48h活体成像仪检测小鼠股四头肌内荧光素酶表达量。两次接种后，剥离不同脉冲电压刺激后的小鼠股四头肌肉组织进行HE染色观察肌肉组织的纤维结构。结果显示：①各质粒在高剂量50μg电穿孔递送时，60V和120V脉冲电压刺激下DNA递送量显著高于30V递送，但60V和120V的DNA递送量无显著性差异；在120V电压刺激后，HE染色检测发现肌肉组织纤维出现明显断裂，溶胀，而在较低电压组60V和30V的电压刺激下未出现明显组织纤维损伤，综合比较，初步推断60V低电压下递送三种类型质粒DNA的表达效果均较优，且局部组织细胞也无明显损伤；②各质粒在低剂量1μg电穿孔递送时，结果发现常规DNA质粒pGL3-CMV、pEE14.1-luc均未检测到荧光素酶基因表达，但可复制型大分子质粒pSVK-luc在60V、120V脉冲电压递送下可见荧光素酶表达，初步推论可复制型质粒在低剂量下接种存在定的优势。 最后，为进步验证低电压下递送DNA疫苗在实际应用中的可行性，以本室前期构建的乙肝可复制型DNA疫苗pSVK-HBVA及常规小分子DNA疫苗pVAX1-HBVA为研究对象，分别设立两种疫苗的高（100μg）中（10μg）低（1μg）三个剂量组，免疫接种BALB/c小鼠，并在60v的低电压下进行电穿孔递送，分别检测两种DNA疫苗在小鼠体内的体液免疫和细胞免疫应答。结果显示：1、低电压（60V）递送乙肝DNA疫苗在体内激起较强的细胞与体液免疫应答;2、60V电压三次免疫接种过程顺利，未见BALB/c小鼠股四头肌肌肉组织僵硬现象，保证多次免疫递送的成功；3，虽抗体滴度呈定的剂量依赖即随着免疫剂量的升高，抗体滴度也逐步升高，但复制子DNA疫苗pSVK-HBVA在常规DNA疫苗1/100的剂量下，即可激活高效的细胞免疫应答，显示出良好应用潜质。 综上所述，本研究以pGL3-CMV、pEE14.1-luc、pSVK-luc为模式质粒，初步验证低电压(60V)递送DNA疫苗可行，又以低脉冲电压（60V）递送本室前期构建乙肝可复制型DNA疫苗pSVK-HBVA和常规乙肝DNA疫苗pVAX1-HBVA，证实低电压电穿孔递送上述疫苗可激活体内高水平的免疫应答，且乙肝可复制子DNA疫苗在常规DNA疫苗1/100的剂量下，即可激活高效的细胞免疫应答，揭示了乙肝可复制型DNA疫苗的良好应用前景和潜质；同时，，进步验证DNA疫苗电穿孔低电压体内递送的可行性，为DNA疫苗电穿孔免疫递送提供重要参考数据更为电穿孔技术的临床应用奠定实验基础。
【关键词】：乙肝可复制型DNA疫苗 荧光素酶基因 电穿孔递送 活体成像技术 细胞免疫 体液免疫
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文缩略语11-16
• 第一部分 前言16-24
• 参考文献20-24
• 第二部分 实验部分24-67
• 第一章 荧光素酶表达质粒 pEE14.1-luc 和 pSVK-luc 的构建与表达24-48
• 1. 材料与方法24-39
• 1.1 材料24-25
• 1.1.1 菌株与载体24
• 1.1.2 化学试剂和酶24-25
• 1.1.3 实验动物和主要仪器设备25
• 1.2 方法25-34
• 1.2.1 pSVK-luc、pEE14.1-luc 重组质粒的构建与鉴定25-30
• 1.2.1.1 pSVK-luc 重组质粒的构建25-26
• 1.2.1.2 PCR 回收产物与 pMDl8-simple-T 载体的连接反应26-27
• 1.2.1.3 大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞的制备27
• 1.2.1.4 大肠杆菌(E. coil)DH5α的转化27-28
• 1.2.1.5 重组质粒 pMD18-simple-T-luc 的筛选与鉴定28-29
• 1.2.1.5.1 重组质粒 pMD18-simple-T-luc 的菌液 PCR 鉴定28
• 1.2.1.5.2 重组质粒 pMD18-simple-T-luc 的酶切鉴定28-29
• 1.2.1.5.3 重组质粒 pMD18-simple-T-luc 的 DNA 测序分析29
• 1.2.1.6 重组质粒 pSVK-luc 的构建29-30
• 1.2.1.6.1 基于塞姆利基森林病毒复制子载体 pSVK 空载体的酶切鉴定29-30
• 1.2.1.6.2 重组质粒 pSVK-luc 构建30
• 1.2.1.6.3 重组表达质粒 pSVK-luc 的转化和鉴定30
• 1.2.2 重组质粒 pEE14.1-luc 的构建30-34
• 1.2.2.1 荧光素酶基因片段（luc）的获得30-32
• 1.2.2.2 荧光素酶基因（luc）片段与 pEE14.1 载体的连接32-34
• 1.3 体外检测荧光素酶基因的表达34-37
• 1.3.1 293T 细胞的培养与转染34-35
• 1.3.1.1 293T 细胞的传代培养34
• 1.3.1.2 293T 细胞的培养与转染34-35
• 1.3.2 western blot 检测 pSVK-luc、pEE14.1-luc 在细胞内表达的检测35-36
• 1.3.3 流式细胞术及免疫荧光法体外检测荧光素酶基因的表达36-37
• 1.4 活体成像技术检测重组质粒 pSVK -luc、pEE14.1-luc 活体内表达37-39
• 1.4.1 免疫用质粒 pSVK -luc、pEE14.1-luc、pGL3-CMV 的大量提取37-38
• 1.4.2 动物免疫方案38-39
• 2. 结果39-44
• 2.1 荧光素酶基因 luc 的克隆39
• 2.2 荧光素酶基因 luc 片段的回收39
• 2.3 重组质粒 pMD18-sample-T-luc 的鉴定39-41
• 2.3.1 重组质粒 pMD18-sample-T-luc 的 PCR 鉴定39-40
• 2.3.2 重组 pMD18-sample-T-luc 载体的酶切鉴定40
• 2.3.3 重组质粒 DNA pMD18-sample-T-luc 的测序分析40-41
• 2.4 塞姆利基森林病毒复制子载体（pSVK 空载体）的酶切鉴定41-42
• 2.4.1 重组质粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的鉴定41-42
• 2.4.1.1 重组质粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的 PCR 鉴定41-42
• 2.4.1.2 重组 pSVK-luc 载体的酶切鉴定42
• 2.4.1.3 重组质粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的测序鉴定42
• 2.5 Western blot 体外检测荧光素酶基因的表达42-43
• 2.6 流式细胞术、免疫荧光体外检测荧光素酶基因的表达43-44
• 2.6.1 流式细胞术检测荧光素酶基因的表达43
• 2.6.2 免疫荧光法体外检测荧光素酶基因的表达43-44
• 2.7 活体成像技术检测重组质粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 体内表达44
• 3. 讨论44-47
• 参考文献47-48
• 第二章 低电压电穿孔体内递送疫苗质粒条件的初步研究48-58
• 1、材料与方法48-52
• 1.1 材料48
• 1.1.1 质粒、实验动物及主要试剂48
• 1.1.2 主要仪器设备48
• 1.2 方法48-52
• 1.2.1 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 质粒的转化48-49
• 1.2.2 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 质粒的大量提取49-50
• 1.2.3 重组质粒 pGL3-CMV、pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 的酶切鉴定50-51
• 1.2.4 动物实验分组及 DNA 免疫策略51
• 1.2.5 Xenogen 成像系统检测萤光素酶在小鼠体内的表达51-52
• 1.2.6 苏木精-伊红（HE）染色检测 BALB/c 小鼠大腿肌肉纤维结构52
• 1.2.7 统计学处理52
• 2．结果52-54
• 2.1 重组质粒 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 的酶切鉴定52
• 2.2 荧光素酶基因小鼠股四头肌内的表达量检测52-53
• 2.3 苏木精-伊红（HE）染色法检测 BALB/c 小鼠大腿肌肉纤维结构53-54
• 3. 讨论54-56
• 参考文献56-58
• 第三章 低电压体内递送乙肝 DNA 疫苗的初步药效学分析58-67
• 1 材料和方法58-59
• 1.1 材料58-59
• 1.1.1 质粒及实验动物58
• 1.1.2 主要试剂及检测试剂盒58
• 1.1.3 主要的仪器设备58-59
• 2 方法59-62
• 2.1 免疫用质粒的大量提取与纯化59
• 2.2 实验动物分组及免疫策略59
• 2.3 乙肝治疗性疫苗 pVAX-HBVA、pSVK-HBVA 的免疫活性研究59-62
• 2.3.1 ELISA 定量检测 BALB/c 小鼠血清中抗 HBcAg 抗体59-60
• 2.3.2 ELISPOT 检测 BALB/c 小鼠 IFN-γ分泌细胞数60-62
• 2.3.2.1 免疫小鼠脾脏单细胞悬液的制备60
• 2.3.2.2 ELISPOT 法检测免疫小鼠脾细胞 IFN-γ分泌细胞数60-61
• 2.3.2.3 CCK-8 法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖61-62
• 2.4 统计学处理62
• 3. 结果62-64
• 3.1 ELISA 定量检测 BALB/c 小鼠血清中抗 HBcAg 抗体62
• 3.2 ELISPOT 检测免疫小鼠 IFN-γ分泌细胞数62-63
• 3.3 CCK8 检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖63-64
• 4 讨论64-66
• 参考文献66-67
• 第三部分 结论与展望67-69
• 第四部分 附录69-72
• 附录一 硕士期间参加的研究课题和发表论文69-70
• 附录二 个人简历70-72
• 致谢72-73

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