尿激酶型纤溶酶原激活物生物传感器的构建及鉴定

发布时间：2017-07-03 06:06

  本文关键词：尿激酶型纤溶酶原激活物生物传感器的构建及鉴定

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【摘要】：背景/目的:构建含有增强型青色荧光蛋白(ECFP)-尿激酶型纤溶酶原激活物(u PA)作用底物(substrate)-黄色荧光蛋白变体(YPet)的真核表达载体(ECFP-u PA substrate-linker-YPet),即uPA的生物传感器(uPAbiosensor)。方法:以现有质粒Src-biosensor为模板,Primer 5.0软件设计YPet引物,设计时5'端引入u PA底物序列及Linker,两端连接酶切位点及保护碱基。以p MDTM-18T为中间载体,通过基因工程方法构建含有ECFP-u PA substrate-linker-YPet的真核表达载体。并进行PCR,双酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞,24h后在荧光显微镜下观察转染效率和融合蛋白表达情况,并用重组人u PA(rhu PA)刺激转染细胞,应用Meta Flour FRET 4.6软件观察并测量u PA生物传感器荧光共振能量转移(FRET)。结果:经过PCR和双酶切鉴定,克隆片段和酶切片段均与u PA substrate分子大小相符;将u PA biosensor转染入293T细胞中,转染效率达40%,并在FRET通道观察到了FRET现象,说明u PA biosensor融合蛋白在活细胞中得到表达,并且用免疫组化方法证明了u PA biosensor的膜表达;rhu PA刺激转染细胞可以检测到FRET现象变化,即在活细胞中证明了u PA biosensor构建成功。结论:u PA生物传感器已经构建成功,该生物传感器能够作为活细胞分子探针研究u PA的时空变化。
【关键词】：尿激酶型纤溶酶原激活物 生物传感器 荧光共振能量转移 骨性关节炎
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R684.3
【目录】：

• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-8
• 英文缩略词8-9
• 前言9-14
• 材料与方法14-25
• 1.材料14-16
• 1.1 菌株，细胞和质粒14-15
• 1.2 主要试剂和酶类15
• 1.3 主要仪器15-16
• 2.主要技术路线图16
• 3.方法16-25
• 结果25-41
• 1 u PA-biosensor质粒的主要部分结构示意图25
• 2 PCR基因的克隆25-26
• 3 u PA-biosensor质粒PCR及双酶切鉴定26-29
• 4 测序结果29-37
• 5 转染细胞u PA biosensor的表达37-39
• 6 rhu PA刺激转染细胞的FRET现象39-41
• 讨论41-44
• 结论44-45
• 参考文献45-49
• 文献综述49-56
• 参考文献54-56
• 致谢56-57
• 作者简介57-58
• 导师评阅表58

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