汉坦病毒感染THP-1细胞激活炎症小体通路及其分子机制的初步研究

发布时间：2017-07-03 12:26

  本文关键词：汉坦病毒感染THP-1细胞激活炎症小体通路及其分子机制的初步研究

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【摘要】：汉坦病毒（Hantavirus）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）、汉坦病毒属（Hantaviruses），有20多个不同的型别。其中的汉滩病毒（Hantaan virus，，HTNV）、汉城病毒（Seoul virus，SEOV）、普马拉病毒（Puumala virus，PUUV）等主要引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever withrenalsyndrome，HFRS），而辛诺柏病毒（SinNombre virus，SNV）等主要引起汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS）。我国流行的汉坦病毒主要是引起HFRS的HTNV和SEOV，尚未发现引起HPS的病毒；而且我国是世界上HFRS疫情最严重的国家，流行范围广，发病人数多，病死率较高，是我国危害最严重的急性传染病之一。 目前HFRS的发病机制尚未完全阐明，学术界普遍认为除了病毒感染直接损伤外，免疫病理损伤导致血管内皮通透性增高和血浆渗漏是HFRS的主要病理基础，其中大量炎症因子的产生是其发生的主要分子基础。已有多项研究显示，HFRS患者外周血中多种细胞因子如VEGF、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-8、IP-10、RANTES等表达水平增多，这些因子与炎症发生密切相关。其中主要由单核/巨噬细胞产生的IL-1β是一种典型的促炎分子，广泛参与机体的炎症反应，并可作为内源性热原质引起机体发热反应，近年来受到广泛关注。由于HFRS的三大主症之一就是发热，同时多项早期的研究表明，HFRS患者体内IL-1β的水平在疾病进程早期即有明显的升高，因此IL-1β在HFRS疾病进程中可能起到了一定的作用。 最新研究表明，炎症小体通路活化是产生IL-1β等细胞因子的主要机制，而且多种病毒感染可激活炎症小体通路。因此，本研究旨在明确汉坦病毒感染人外周血单核细胞THP-1后是否可产生IL-1β，并探讨IL-1β的产生是否与炎症小体通路的活化相关及其具体分子机制，从而为进一步阐明IL-1β在汉坦病毒感染致病中的作用及其机制等提供理论和实验基础。 【主要实验方法和研究结果】 1．HTNV可感染THP-1细胞并复制 利用乳鼠脑扩增HTNV76-118株，制备病毒悬液，用微量细胞培养法测定病毒滴度为1.95×106PFU/ml。取MOI=10的HTNV分别感染THP-1、HUVEC和Vero E6细胞，24h后用FITC标记的抗汉坦病毒核衣壳蛋白的mAb进行免疫荧光检测，结果显示：在THP-1、HUVEC、Vero E6细胞的胞浆中均可见特异的绿色荧光颗粒，但是在THP-1细胞中的绿色荧光颗粒较HUVEC、Vero E6细胞中的为少。这提示HTNV可以感染THP-1细胞并增殖，但其复制水平低于在Vero E6细胞和HUVEC中的复制水平。 2．HTNV感染THP-1细胞后可诱导表达IL-1β 用MOI=1、MOI=2和MOI=10的HTNV76-118株分别感染THP-1细胞，同时设LPS、ATP刺激为阳性对照，灭活病毒为阴性对照组，2h后换液并继续培养细胞；24h后收集细胞上清，用ELISA检测其中的IL-1β。结果显示，不同MOI的HTNV均可诱导THP-1细胞产生IL-1β，使用的病毒量越大，细胞分泌IL-1β的水平也越高。为观察LPS预刺激是否影响HTNV感染THP-1细胞产生IL-1β的水平，先用0.05mg/ml的LPS对细胞预刺激2h，并设无LPS预刺激组；之后用MOI=0.1、MOI=2的HTNV分别进行感染，2h后换液并继续培养细胞；24h后收集细胞上清，用ELISA检测其中的IL-1β。结果显示，LPS预刺激对HTNV感染THP-1细胞生成IL-1β的水平没有明显影响。为观察病毒感染细胞后不同时间点IL-1β水平的变化，用MOI=1、MOI=10的HTNV感染THP-1细胞，2h后换液并继续培养细胞，分别在6h、24h和48h收集细胞上清，用ELISA检测其中的IL-1β。结果显示，感染的THP-1细胞生成的IL-1β水平呈现先上升后下降的趋势，其中在24h时检测到的IL-1β水平最高；MOI=10的病毒感染THP-1细胞表达IL-1β的水平升高后下降趋势比MOI=1时的下降趋势减缓。以上实验结果说明HTNV感染THP-1细胞诱导表达了IL-1β。 用1mM的蛋白酶体抑制剂MG132预处理THP-1细胞2h，用MOI=10的HTNV感染细胞，2h后换液并继续培养细胞；24h后收集细胞上清，用ELISA检测其中的IL-1β。结果显示，MG132处理细胞后，可明显抑制HTNV感染THP-1生成IL-1β的水平，这提示HTNV感染细胞后IL-1β的产生不是病毒直接作用的结果，而是通过病毒活化某种分子通路所介导的。 3．HTNV感染THP-1细胞激活了炎症小体通路相关分子 用MOI=10的HTNV76-118株和灭活的该毒株分别感染THP-1细胞，2h后换液并继续培养细胞；在感染后6h、24h分别收集细胞，并提取细胞RNA后进行反转录，用qRT-PCR检测炎症小体通路中NLRP3、ASC、caspase-1及RIG-I的mRNA水平。结果显示，与未感染组相比，HTNV活毒株和灭活毒株感染THP-1细胞中NLRP3、RIG-I分子的mRNA水平没有明显变化，而接头分子ASC的mRNA则在6h时开始有显著的升高，caspase-1的mRNA水平在24h时有显著的升高。用MOI=10的HTNV感染THP-1细胞，同时设LPS及ATP作为阳性对照处理THP-1细胞，2h后换液并继续培养细胞；在感染后6h和24h后分别收集细胞和培养上清，用Western blot检测pro-caspase-1、pro-IL-1β及caspase-1。结果显示，HTNV感染THP-1细胞和LPS+ATP阳性对照组细胞中pro-caspase-1及pro-IL-1β水解单体水平均明显高于未感染组；HTNV感染THP-1细胞和LPS+ATP阳性对照组细胞上清中的caspase-1水平明显高于未感染组。 4．HTNV感染THP-1细胞激活炎症小体不依赖于K+外流 为检测K+外流是否作为HTNV感染THP-1细胞激活炎症小体的潜在机制，我们用3M KCl加入THP-1细胞中作用2h，再用MOI=10的HTNV76-118株感染细胞，2h后换液并继续培养细胞；24h后收集细胞上清，用ELISA检测其中的IL-1β，结果显示，当胞外有或无高浓度的K+存在时，HTNV均可诱导THP-1细胞产生IL-1β，两者水平相当，表明HTNV刺激炎症小体通路不依赖K+外流。 【结论】 汉坦病毒感染THP-1细胞后可产生IL-1β，炎症小体通路的激活是其产生的分子机制，且该通路的激活不依赖K+外流，但汉坦病毒激活炎症小体通路的分子机制尚需进一步阐明。本研究为深入理解IL-1β在HTNV感染致病过程中的作用及其具体机制提供了实验基础。
【关键词】：汉坦病毒 肾综合征出血热 人急性单核白血病细胞（THP-1） 炎症小体 IL-1β
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.9
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-17
• 前言17-19
• 文献回顾19-31
• 1 材料31-33
• 1.1 病毒、细胞、动物31
• 1.2 主要仪器31-32
• 1.3 主要试剂32-33
• 1.4 常用液体的配制33
• 2 实验方法33-40
• 2.1 HTNV 76-118 株的增殖及滴度测定33-34
• 2.2 THP-1 细胞分化为巨噬样细胞的诱导34
• 2.3 HTNV 感染 THP-1 细胞及其免疫荧光法检测34-35
• 2.4 ELISA 法检测 HTNV 感染 THP-1 细胞上清中的 IL-1β水平35-37
• 2.5 实时定量 PCR检测 HTNV感染 THP-1 细胞中炎症小体相关分子的 mRNA37-38
• 2.6 Western Blot 检测 HTNV 感染 THP-1 细胞中 caspase-1 和 IL-1β38-40
• 2.7 HTNV 激活炎症小体与 K+外流相关性的检测40
• 3 结果40-48
• 3.1 HTNV 76-118 株的滴度测定结果40-41
• 3.2 诱导 THP-1 细胞分化为巨噬样细胞的结果41
• 3.3 HTNV 感染 THP-1 细胞的免疫荧光检测结果41-42
• 3.4 HTNV 感染 THP-1 细胞上清中 IL-1β的检测结果42-45
• 3.5 HTNV 感染 THP-1 细胞中炎症小体相关分子 mRNA 的检测结果45-46
• 3.6 HTNV 感染 THP-1 细胞中炎症小体相关分子的 Western blot 检测结果46-48
• 3.7 HTNV 激活炎症小体与 K+外流相关性的检测结果48
• 4 讨论48-53
• 小结53-54
• 参考文献54-62
• 个人简历和研究成果62-63
• 致谢63-64

【共引文献】

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本文编号：513687