与羊膜上皮细胞共培养对羊膜间充质干细胞生物学特性的影响

发布时间：2017-07-04 15:18

  本文关键词：与羊膜上皮细胞共培养对羊膜间充质干细胞生物学特性的影响

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【摘要】：目的：成体干细胞是具有多向分化潜能的细胞,在组织工程、细胞移植及基因工程方面具有良好的应用前景。近年来的研究发现,人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSC)在体外具有与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)相似的造血重建功能,并因其取材方便、来源丰富等优势有望成为一种更加理想的MSC临床及科研新来源。同样来源于羊膜的羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells, AEC)不仅具备干细胞的生物学特性,还能分泌多种细胞因子。本课题旨在探索AMSC与AEC在体外共培养后,AMSC生物学特性的变化。SDF-1/CXC4轴是介导MSC在体内归巢及植入的重要的生物轴,本研究对比共培养前后AMSC中CXCR4的表达,探讨SDF-1/CXCR4轴在AMSC归巢、迁移过程中的作用,以期为AMSC临床应用奠定基础,并希望为临床提高MSC移植疗效提供实验依据。 方法：分别采用组织块法和消化法从羊膜中分离、培养AMSC和AEC,用密度梯度离心法从健康人骨髓标本中分离、培养BMSC,进行扩增及鉴定。选取P3代传代培养24h后AMSC和BMSC的培养基上清液,检测其中IL-6的含量,同时对比两种细胞上IL-6受体(CD126)的表达。用millicell小室建立间接共培养体系,实验分组为AMSC与AEC共培养组、无血清AMSC培养组、血清AMSC培养组(即常规培养组),应用CCK-8法及台盼蓝染色法观察共培养24h、48h、72h对AMSC细胞活力的影响；采取包括流式免疫分析、real-time RT-PCR等方法对AMSC中CXCR4的表达进行检测,并结合millicell小室探索共培养对AMSC体外迁移能力的影响。 结果：1、从羊膜分离出的AMSC在形态和表型上均符合MSC特征,流式分析显示其上表达CD29、CD44、CD105,不表达或低表达CDlla、CD11b、CD31、CD34、 CD45、HLA-DR、pan-CK。2、AMSC与BMSC有相似生物学特性,二者流式免疫表型基本一致。3、AMSC能合成和分泌比BMSC更为丰富的IL-6,同时CD126的表达亦高于BMSC。4、通过CCK-8法显示：虽然在24h三组细胞增殖活性无明显差异,但是在48h、72h后共培养组细胞与血清培养组细胞的活性明显的高于无血清AMSC组。5、台盼蓝染色进一步证实,无论在哪个时间位点,共培养组及血清培养组的存活率均高于无血清培养组。6、流式细胞仪检测提示：AMSC胞内的CXCR4在24h内呈现出共培养组高于无血清培养组的表达,但与血清培养组无明显差异,在接下来的48h及72h,三组细胞CXCR4的胞内表达无明显差别；对于细胞表面CXCR4,三个培养时间位点却均显示出血清培养组在CXCR4表面表达的劣势,而共培养与无血清培养组之间的表达无差别。7、通过real-time RT-PCR在mRNA水平上检测三种培养方式对细胞中CXCR4的表达,结果表明共培养及无血清培养组在三个时间位点均高于血清培养组,而共培养与无血清培养组之间差异无统计学差异。8、AMSC体外能够沿SDF-1浓度梯度趋化迁移,共培养组与无血清培养组迁移细胞数无统计学差别,但两组的AMSC的迁移数在三个时间位点均高于血清培养组。 结论：AMSC与AEC能够在体外分离、培养、扩增。AMSC在体外与BMSC有相似的生物学特性,二者均能合成和分泌IL-6,但AMSC表达更为丰富的IL-6受体(CD126),提示在组织的损伤修复及造血调控方面,AMSC可能具有比BMSC更广阔的应用前景。经AEC共培养的AMSC表现出良好的生长活性,并能上调CXCR4的表达,增强其迁移能力。
【关键词】：羊膜间充质干细胞 羊膜上皮细胞 归巢 CD126 CXCR4 迁移
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 第一部分 AMSC与AEC的分离培养及鉴定10-34
• 实验材料11-14
• 实验方法14-19
• 结果19-31
• 讨论31-34
• 第二部分 与AEC共培养对AMSC生物学特性的影响34-55
• 实验材料35-37
• 实验方法37-44
• 实验结果44-52
• 讨论52-55
• 结论55-56
• 参考文献56-59
• 综述59-67
• 参考文献64-67
• 英文缩写词一览表67-68
• 攻读学位期间发表论文情况68-69
• 致谢69

【参考文献】

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1 章守琴;李维佳;史明霞;钱永海;;人羊膜间充质干细胞支持造血的体外实验[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年49期

2 赵智刚,唐晓琼,李静,史明霞,邹萍;慢性粒细胞性白血病骨髓间充质干细胞的分离纯化及其功能特性的研究[J];中华医学杂志;2005年29期

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本文编号：518295