携带CARex和PTDtat的重组5型腺病毒的获得及其对日本血吸虫童虫感染效率的研究

发布时间：2017-07-04 19:16

  本文关键词：携带CARex和PTDtat的重组5型腺病毒的获得及其对日本血吸虫童虫感染效率的研究

  更多相关文章： 腺病毒 CARex PTDtat 感染效率 日本血吸虫童虫

【摘要】：目的RNAi已经成为生物体基因功能分析的非常重要的工具，虽然有文献报道成功地将dsRNA通过浸泡或电穿孔方法导入血吸虫各期达到基因沉默作用，然而这一技术在血吸虫研究应用中目前仍然存在一些问题，包括如何高效的将dsRNA、siRNA或shRNA表达载体高效地递送到虫体、降低递送方法导致的死亡和达到长期干扰效果，RNAi的长期应用就需要克服这些难关。本课题主要是研究Ad5能否感染日本血吸虫童虫，及其感染效率如何，并且对Ad5进行了改建，插入可以提高Ad5感染效率的基因来增加Ad对日本血吸虫的感染的可能性，作为Ad5应用于日本血吸虫童虫RNAi的前期研究，为探索腺病毒载体介导的日本血吸虫童虫RNAi奠定初步的实践基础。。 方法通过体外连接方法成功构建携带CARex、PTDtat和CARex-PTDtat融合基因的重组5型腺病毒质粒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat质粒；经Pac I酶切线性化在脂质体的介导下转染293A细胞，在包装细胞293A细胞中成功包装出具有感染力的重组病毒颗粒；扩增3代后，PCR鉴定目的基因的成功插入，然后用半数组织培养感染量（TCID50）法测定病毒颗粒的滴度，滴度在108-109之间，为了得到高滴度的重组腺病毒，用氯化铯密度梯度离心法对重组腺病毒进行纯化，纯化后的病毒滴度为1011。用3种重组腺病毒和野生型腺病毒分别感染CAR表达量不同的肿瘤细胞株，包括高表达的A549、中表达的HepG2和低表达的T24细胞，48h后倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达，然后流式细胞术检测GFP阳性细胞百分比及荧光强度。收集50只日本血吸虫阳性钉螺的尾蚴，通过机械法将尾蚴转化为童虫，然后进行童虫实验分别于48h后倒置荧光显微镜观察观察GFP在童虫体内的表达情况。 结果成功构建和包装重组5型腺病毒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat，细胞实验显示重组腺病毒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat组细胞GFP的表达量均高于野生型pAd，但是pAd-CARex-PTDtat作用效果要低于pAd-CARex和pAd-PTDtat组。流式细胞术显示在A549、HepG2和T24细胞GFP阳性细胞的百分比是：野生型pAd组分别为54.8%、38.2%和8.52%；经改建的重组pAd-CARex组分别为90.4%、79.2%和32.1%；重组pAd-PTDtat组分别为95.8%、98.8%和93.9%；重组pAd-CARex-PTDtat组分别为70.5%、53.4%和13.3%，在3种细胞中重组pAd-CARex与野生型pAd组相比较GFP阳性细胞数平均提高33%，并且在3种细胞提高的百分比无明显差别；重组pAd-PTDtat组平均提高61.6%，在T24细胞中提高近85%，在A549细胞提高了41%，在HepG2细胞提高了60%，具有明显的作用效果，重组pAd-CARex-PTDtat平均提高仅仅约10%。4种重组病毒的平均荧光强度在A549细胞最强，HepG2次之，T24最弱。各组细胞平均荧光强度中pAd-PTDtat组最强，pAd-CARex次之，pAd-CARex-PTDtat组最弱，，但是3组都高于野生型pAd。童虫实验结果显示：荧光显微镜检查野生型pAd组、pAd-CARex和pAd-CARex-PTDtat均未见到GFP的表达，只有PTDtat组能看到微弱的GFP的表达。 结论实验结果表明CARex、PTDtat基因可以提高Ad5对CAR表达量的不同肿瘤细胞的感染效率，尤其是低表达CAR的肿瘤细胞，PTDtat基因的作用效果优于CARex，但是将两者联合在一起作用效果反而较差；童虫实验结果显示野生型pAd和pAd-CARex和pAd-CARex-PTDtat不能感染日本血吸虫童虫，只有经过改建后的重组腺病毒pAd-PTDtat对童虫有微弱的感染，说明PTDtat基因的作用效果较好，可以提高Ad5对肿瘤细胞和日本血吸虫童虫的感染效率。
【关键词】：腺病毒 CARex PTDtat 感染效率 日本血吸虫童虫
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R383.24
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-31
• 结果31-49
• 讨论49-52
• 结论52
• 参考文献52-56
• 附录一 部分试剂配方56-60
• 附录二 个人简历60-61
• 附录三 致谢61-62
• 附录四 综述62-70
• 参考文献67-70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王颖;;中国血吸虫病流行范围及其与防治工作的关系[J];中国初级卫生保健;2010年05期

本文编号：519038