PRMT5对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

发布时间：2017-07-06 19:13

  本文关键词：PRMT5对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

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【摘要】：目的： 该研究主要探索骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化过程中的表观遗传学之甲基化修饰的改变，主要观察蛋白质精氨酸甲基转移酶5（protein arginine methyl transferase，PRMT5）的变化。实验从基因及蛋白水平检测PRMT5在BMSCs成骨分化过程的变化，为进一步研究表观遗传对BMSCs成骨分化的影响提供基础。 方法： 1.提取SD大鼠BMSCs，用全骨髓贴壁法进行培养得到P3代细胞，观察细胞生长过程的形态变化，并用酶标仪检测生长曲线，用流式细胞术检测细胞相关表面抗原的表达情况，对细胞进行经典成骨诱导，并用茜素红染色，观察细胞成骨分化能力，鉴定BMSCs。 2.从基因水平检测PRMT5在BMSCs成骨分化过程的变化，将P3代细胞种于6孔板，实验分实验组和对照组，实验组用经典成骨诱导液培养细胞，对照组用含10%FBS的DMEM培养细胞，用实时荧光定量PCR（qPCR）法分别检测实验组和对照组培养3天、6天、12天和24天的PRMT5基因表达情况，并绘制变化趋势曲线图进行对比。 3.从蛋白水平检测PRMT5在BMSCs成骨分化过程的变化，将P3代细胞种于6孔板，实验分实验组和对照组，实验组用经典成骨诱导液培养细胞，对照组用含10%FBS的DMEM培养细胞，用western blot方法分别检测实验组和对照组培养3天、6天、12天和24天的PRMT5蛋白表达情况，并进行对比。 结果： 1.全骨髓贴壁法获得的P3代BMSCs生长增值良好，显微镜下见呈漩涡状生长，酶标仪检测生长曲线变化符合典型BMSCs特征，流式细胞仪检测细胞表面抗原表达正常，其中CD29表达99.93%，CD44表达99.46%，CD31表达0.01%，CD45表达0.01%，成骨诱导21天后茜素红染色可见明显钙结节，证明所提细胞为BMSCs。 2.提取细胞总RNA逆转录后，加PRMT5引物进行PCR扩增，得到PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳验证所需产物为目标基因即PRMT5基因，进行qPCR结果显示实验组3-24天的PRMT5的mRNA表达量呈下降趋势，而对照组3-24天PRMT5的mRNA表达量基本不变。 3.提取细胞总蛋白后，用western blot方法检测PRMT5蛋白表达水平，用PRMT5单克隆抗体及二抗孵育后用ECL发光液进行显色拍照发现实验组3-24天PRMT5蛋白表达呈下降趋势，而对照组3-24天PRMT5蛋白表达基本不变。 结论： 1.全骨髓贴壁法适合BMSCs的提取，纯化。 2. PRMT5在BMSCs成骨分化过程基因及蛋白均表达降低，可能扮演抑制BMSCs成骨分化的角色。
【关键词】：PRMT5 BMSCs 表观遗传学 qPCR western blot
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 1 绪论8-16
• 1.1 BMSCs 概况8-9
• 1.2 表观遗传概况9-14
• 1.3 本研究的设计思路与内容14
• 1.4 本研究的创新与不足14-16
• 2 实验一 BMSCs 提取、培养及鉴定16-30
• 2.1 研究目的16
• 2.2 实验材料16-17
• 2.3 实验方法17-22
• 2.4 结果22-23
• 2.5 讨论23-25
• 2.6 结论25
• 2.7 附图25-30
• 3 实验二 BMSCs 成骨诱导过程 PRMT5 的 mRNA 表达情况30-39
• 3.1 研究目的30
• 3.2 实验材料30-31
• 3.3 实验方法31-35
• 3.4 结果35-37
• 3.5 讨论37-38
• 3.6 结论38-39
• 4 实验三 BMSCs 成骨诱导过程 PRMT5 的蛋白表达情况39-46
• 4.1 研究目的39
• 4.2 实验材料39-40
• 4.3 实验方法40-43
• 4.4 结果43-44
• 4.5 讨论44-45
• 4.6 结论45-46
• 5 英文缩略词46-47
• 6 参考文献47-53
• 7 发表论文及参与学术活动53-54
• 8 致谢54-55

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