HGF促进hUCMSCs血管新生的体外研究

发布时间：2017-07-07 03:15

  本文关键词：HGF促进hUCMSCs血管新生的体外研究

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【摘要】：目的：缺血性疾病，如缺血性脑卒中、缺血性心肌病、股骨头缺血性坏死、缺血性肠病等，是临床上一类严重危害人民群众健康的疾病。随着近年来社会和经济的不断发展人们膳食结构的改变，高糖高脂饮食，生活工作压力增加，社会人口老年化等原因，导致该类疾病的发病率逐年上升并且趋向年轻化，已成为困扰公众的社会问题。由于该类疾病致病过程慢性进行性、发病突然、致死致残率高，不但严重影响了患者生活质量，使其饱受痛苦，还给其家庭、社会及国家带来了沉重负担。 目前临床上通过采用药物溶栓或抗凝、血管搭桥、介入手术等方式治疗，在一定程度上可以改善患者的症状，但如果血管呈弥漫性病变或病变发生在直径小于2mm的小血管，则无法取得满意疗效，而且手术存在再灌注损伤、危险性大、并发症多、费用昂贵、术后再狭窄等缺点。因此，探索一个有效、简便、可行的治疗方法是当前迫切需要解决的问题。 1993年，由Hockel等最早提出的应用治疗性血管新生疗法，通过刺激局部血管的再生和损伤组织的再建达到治疗目的，是目前缺血性疾病治疗、创伤修复等领域备受瞩目的研究重点[1]。前期我们发现HGF有促进烧伤创面愈合，修复创伤部位[2]；对犬下肢静脉缺血模型的血管及肌肉等组织具有保护作用[3,4]；同时可以上调Notch1及Dll4的mRNA水平[5]。基于此，本研究以hUCMSCs为体外研究细胞模型，以前期课题组合成的重组腺病毒Ad-HGF为研究对象，系统分析Ad-HGF通过Notch1/Dll4信号通路的调控作用对hUCMSCs增殖能力、细胞周期、细胞毛细管腔状结构形成、迁移能力等功能的影响；Notch1/Dll4信号通路及血管动静脉标志物转录水平及蛋白表达水平的变化。最终阐明HGF与hUCMSCs信号通路的关系及机制，揭示Ad-HGF促进动静脉血管分化的作用，具有重要的理论意义和应用价值。 一、人脐带间充质干细胞的分离培养、鉴定及诱导分化。 方法：取正常足月生产新生儿脐带，采取组织贴壁法分离原代hUCMSCs，观察细胞生长形态。采取流式细胞仪技术检测hUCMSCs细胞表型及细胞周期。通过成神经细胞诱导和成脂肪细胞诱导鉴定hUCMSCs的诱导分化能力。 结果：成功分离和培养hUCMSCs原代细胞。细胞经流式细胞仪鉴定高表达间质细胞标志CD44（96.73%）和CD105（96.10%），整合素受体CD29（99.53%）；低表达造血系标志CD34（0.8%）和CD45（1.91%），人白细胞抗原HLA-DR（1.41%），符合hUCMSCs细胞表型特征。细胞周期检测大部分hUCMSCs处于G0/G1期。hUCMSCs成神经细胞诱导，出现神经元样细胞，Nestin蛋白免疫组化检测阳性。hUCMSCs成脂肪细胞诱导，出现空泡样脂滴，油红O染色检测阳性。 结论：成功分离及培养了具有多向分化潜能的hUCMSCs，可以用于后续实验的研究。 二、人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定。 方法：根据Gene Bank中Notch1基因mRNA序列(NM_017617)设计合成shRNA序列，并且连接到pGenesil-1.1质粒上，酶切及测序鉴定。通过体外同源重组将Notch1-shRNA表达框转移至腺病毒表达载体pGsadeno上，酶切线性化后脂质体转染包装细胞HEK293，制备获得重组腺病毒。腺病毒转染hUCMSCs，观察细胞形态及GFP蛋白的表达，，提取总RNA和总蛋白，RT-PCR及Western Blot检测细胞Notch1的转录及蛋白表达水平。 结果：经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确。转染hUCMSCs后，RT-PCR及Western Blot检测，可显著抑制细胞Notch1的基因转录及蛋白表达，对基因转录沉默效率约为68.04%（P＜0.05）；对蛋白表达默效率约为80.32%（P＜0.05）。 结论：成功构建了重组腺病毒rAd5-Notch1-shRNA，能高效转染hUCMSCs细胞，具有Notch1基因沉默效应。 三、Ad-HGF诱导hUCMSCs向血管动静脉内皮细胞分化的体外研究。 方法：以hUCMSCs为研究对象，实验分为五组：腺病毒Ad-GFP组、Ad-GFP-Notch1-shRNA组（简称为Ad-shRNA组）、Ad-GFP-NICD组（简称为Ad-NICD组）、Ad-HGF组和空白对照组。首先通过MTT实验检测各组细胞生存率，判定各组腺病毒的最佳感染MOI。显微镜下观察各组细胞形态。ELISA实验检测Ad-HGF组细胞培养上清中HGF的表达水平。MTT法测定OD490nm值，绘制细胞生长曲线。流式细胞仪检测各组细胞周期情况。随后分别检测各组细胞贴壁能力、迁移能力及体外成血管能力。实时定量荧光PCR法检测Notch信号通路中：Notch1、Dll4及Hey-2基因；静脉标志物EphB4基因；动脉标志物ephrin B2基因的转录水平。最后WesternBolt检测Notch1、EphB4及ephrin B2蛋白的表达。 结果：Ad-GFP组最佳MOI为100倍；Ad-NICD组、Ad-shRNA组及Ad-HGF组最佳MOI为50倍。转染后镜下观察，除Ad-HGF组外，其他各组，均出现GFP的表达；Ad-NICD组，细胞增殖速度快，形成多个不完整的管腔样结构；Ad-HGF组，细胞分散生长，早期增殖速度较快，随后出现了大量的分泌小泡。ELISA检测Ad-HGF组培养48h后，上清中HGF的表达与对照组相比显著增多（P＜0.05），96h达到峰值562.97±27.09pg/mL。Ad-NICD组和Ad-HGF组能显著促进细胞增殖，在48、72、96h时具有显著差异（P＜0.05）；Ad-shRNA组能抑制细胞增殖，在72h时具有显著差异（P＜0.05）。流式细胞仪检测，Ad-NICD组细胞S期比例有较大增高（36.02%），细胞DNA复制活跃，具有较强增殖活性。细胞贴壁实验中，Ad-HGF组在12、16、20h及Ad-NICD组在20h细胞贴壁率大于对照组（P＜0.05）；Ad-shRNA组在8、12、16h细胞贴壁率小于对照组（P＜0.05）。Transwell小室实验发现Ad-HGF组及Ad-NICD组能促进细胞迁移，而Ad-shRNA组抑制细胞迁移（P＜0.05）。体外成血管实验，Ad-NICD组和Ad-HGF组出现了明显的管状结构，其余各组未见。实时定量荧光PCR检测，Ad-HGF组及Ad-NICD组的Notch1、Dll4、Hey-2基因转录水平高于其余各组（P＜0.05），而Ad-shRNA组则低于其余各组（P＜0.05），Ad-GFP组与空白对照组之间、Ad-HGF组与Ad-NICD组之间无统计学差异（P0.05）。静脉标志物EphB4基因，Ad-GFP组、Ad-HGF组及Ad-shRNA组与空白对照组相比较，无统计学差异（P0.05），而Ad-NICD组基因转录水平高于空白对照组（P0.05）。动脉标志物ephrin B2基因，Ad-GFP组、Ad-shRNA组和空白对照组之间、Ad-HGF组与Ad-NICD组之间，无统计学差异（P0.05），Ad-HGF组和Ad-NICD组细胞的ephrin B2基因转录水平高于其余各组（P0.05）。Western Blot检测，Ad-HGF组与Ad-NICD组高表达Notch1蛋白和ephrin B2蛋白，Ad-shRNA组低表达Notch1蛋白和ephrin B2蛋白，具有统计学差异（P0.05）。 结论：HGF能通过激活Notch1/Dll4信号通路诱导hUCMSCs向动脉血管分化。
【关键词】：肝细胞生长因子 人脐带间充质干细胞 血管新生 Notch1 腺病毒 EphB4 ephrin B2
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-20
• 文献回顾20-28
• 第一部分 人脐带间充质干细胞的分离培养、鉴定及诱导分化28-40
• 1 材料28-30
• 1.1 主要仪器设备28
• 1.2 主要试剂和材料28-30
• 2 方法30-33
• 2.1 hUCMSCs 的原代培养30-31
• 2.2 hUCMSCs 流式细胞仪检测31
• 2.3 hUCMSCs 成神经细胞诱导实验31-32
• 2.4 hUCMSCs 成脂肪细胞诱导实验32-33
• 3 结果33-37
• 3.1 hUCMSCs 原代培养及细胞形态学观察33-34
• 3.2 hUCMSCs 细胞流式细胞仪检测34-35
• 3.3 hUCMSCs 细胞成神经细胞诱导35-36
• 3.4 hUCMSCs 细胞成脂肪细胞诱导36-37
• 4 讨论37-40
• 第二部分 人 NOTCH1受体SHRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定40-61
• 1 材料40-43
• 1.1 主要仪器设备40
• 1.2 质粒、菌株及细胞株40-41
• 1.3 其他材料41-43
• 2 方法43-53
• 2.1 shRNA 的设计及合成43-44
• 2.2 重组质粒 pGenesil-1.1-Notch1-shRNA 的构建及鉴定44-46
• 2.3 重组腺病毒表达质粒 pGsadeno- Notch1-shRNA 的构建及鉴定46-47
• 2.4 重组腺病毒 rAd5-Notch1-shRNA 的制备47-48
• 2.5 重组腺病毒 rAd5-Notch1-shRNA 的滴度测定48-49
• 2.6 重组腺病毒 rAd5-Notch1-shRNA 沉默效应鉴定49-53
• 3 结果53-57
• 3.1 重组质粒 pGenesil-1.1-Notch1-shRNA 的构建及鉴定53-55
• 3.2 重组腺病毒质粒 pGsadeno-Notch1-shRNA 的构建及鉴定55
• 3.3 重组腺病毒 rAd5-Notch1-shRNA 的制备55
• 3.4 腺病毒转染 hUCMSCs 细胞形态及 GFP 表达情况的观察55-56
• 3.5 腺病毒转染 hUCMSCs 后，对 Notch1 转录水平的沉默效应56
• 3.6 腺病毒转染 hUCMSCs 后，对 Notch1 蛋白表达水平的沉默效应56-57
• 4 讨论57-61
• 第三部分 AD-HGF诱导HUCMSCS向血管动静脉内皮细胞分化的体外研究61-82
• 1 材料61-63
• 1.1 主要仪器设备61
• 1.2 腺病毒及细胞株61-62
• 1.3 引物合成、工具酶等62
• 1.4 主其他要试剂及材料62
• 1.5 常用试剂的配置方法62-63
• 2 方法63-66
• 2.1 腺病毒感染 hUCMSCs 最佳 MOI 的测定63
• 2.2 腺病毒感染 hUCMSCs 细胞形态学观察63
• 2.3 ELISA 检测腺病毒 Ad-HGF 感染 hUCMSCs 后 HGF 水平63-64
• 2.4 MTT 检测腺病毒感染 hUCMSCs 生长的影响64
• 2.5 流式细胞仪检测腺病毒感染 hUCMSCs 细胞生长周期的影响64
• 2.6 细胞贴壁实验检测腺病毒感染 hUCMSCs 贴壁能力的影响64
• 2.7 Transwell 小室检测腺病毒感染 hUCMSCs 迁移能力的影响64-65
• 2.8 体外成血管实验检测腺病毒感染 hUCMSCs 血管生成能力的影响65
• 2.9 实时定量荧光 PCR 检测血管分化相关基因的转录水平65-66
• 2.10 Western Blot 检测血管分化相关蛋白的表达水平66
• 2.11 统计学分析66
• 3 结果66-76
• 3.1 腺病毒感染 hUCMSCs 最佳 MOI 的测定66-67
• 3.2 腺病毒感染 hUCMSCs 细胞形态学观察67-68
• 3.3 ELISA 检测腺病毒 Ad-HGF 感染 hUCMSCs 后 HGF 水平68-69
• 3.4 MTT 检测腺病毒感染 hUCMSCs 生长的影响69-70
• 3.5 流式细胞仪检测腺病毒感染 hUCMSCs 细胞生长周期的影响70
• 3.6 细胞贴壁实验检测腺病毒感染 hUCMSCs 贴壁能力的影响70-71
• 3.7 Transwell 小室检测腺病毒感染 hUCMSCs 迁移能力的影响71-73
• 3.8 体外成血管实验检测腺病毒感染 hUCMSCs 血管生成能力的影响73
• 3.9 实时定量荧光 PCR 检测血管分化相关基因的转录水平73-75
• 3.10 Western Blot 检测血管分化相关蛋白的表达水平75-76
• 4 讨论76-82
• 小结82-83
• 参考文献83-95
• 个人简历和研究成果95-97
• 致谢97

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 高玉芳;哈小琴;付晓霞;吕同德;唐瑜;贾庆华;;HGF对人股动脉内皮细胞中Notch1和Dll4基因转录的调节作用[J];第四军医大学学报;2009年20期

2 哈小琴,苑宾,李元敏,劳妙芬,吴祖泽;Gene therapy for pathological scar with hepatocyte growth factor mediated by recombinant adenovirus vector[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2003年03期

3 程欣;皮婷;肖飞;马刘红;徐建兵;罗焕敏;;人脐带间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞[J];基础医学与临床;2011年03期

4 马锡慧;冯凯;石炳毅;;人脐带间充质干细胞生物学特性及其研究进展[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年32期

5 黄韵,哈小琴,吴祖泽;腺病毒介导人肝细胞生长因子对大鼠皮层神经元损伤的保护作用[J];中国应用生理学杂志;2004年02期

6 哈小琴;任建平;吕同德;张庆林;毕建进;吴祖泽;;局部pUDKH基因治疗对实验性犬缺血肢体的某些生理、生化变化的影响[J];中国应用生理学杂志;2007年02期

7 哈小琴,李元敏,劳妙芬,苑宾,吴祖泽;Effect of human hepatocyte growth factor on promoting wound healing and preventing scar formation by adenovirus-mediated gene transfer[J];Chinese Medical Journal;2003年07期

本文编号：528710