新型IRE1α-XBP1通路小分子调节剂的发现与作用机制研究

发布时间：2017-07-15 15:04

  本文关键词：新型IRE1α-XBP1通路小分子调节剂的发现与作用机制研究

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【摘要】：由内质网应激(ER stress)引发的未折叠蛋白应答(unfolded protein response, UPR)与许多疾病密切相关。IRE la (Inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease-1)在UPR感受器中最保守,其功能是通过核酸内切酶活性将底物XBP1(X-box binding protein-1) mRNA剪切后,形成有活性的转录因子XBP1s进入细胞核中启动其下游基因缓解内质网应激。研究表明IRE1a-XBP1在多种疾病中处于激活状态,包括癌症、糖尿病、肥胖、亨廷顿综合症等。因此寻找IRE1a的调节剂对IRE1a-XBP1信号通路的调控机制以及相关疾病的治疗具有重要意义。 我们通过XBP1-DBD-luc细胞模型对438个化合物进行筛选,得到28个UPR调节剂,并且利用优化的IRE1a核酸酶分子模型评价得到个7个IRE1a核酸酶抑制剂。随后采用RT-PCR方法确定化合物对XBP1剪切的影响,以及对UPR其他相关指针基因GRP78和CHOP mRNA水平的影响,进一步确定化合物在细胞水平对IRE1a-XBP1通路调节的特异性与选择性。 我们发现化合物21#在分子水平可直接抑制IRE1a核酸酶活性,其IC50为340nM,且不抑制RNase A活性,表明其对IRE1a核酸酶的抑制作用具有选择性。目前已知的IRE1a核酸酶直接抑制剂是通过与IRE1a核酸酶的907位赖氨酸发生共价结合而抑制酶活。我们发现21#分子水平与DTT反应产生ROS而抑制IRE1a酶活性,提示21#抑制IRE1a酶活的作用可能与ROS有关,提示我们IREla酶活性可能被氧化应激所调控,但H2O2和zhang400-l对IREla核酸酶活影响很弱,进一步提示我们21#抑制IRE1a核酸酶活性与其化学结构有关。在细胞水平上,21#在10μ,M浓度下完全抑制1μg/mL衣霉素诱导的XBP1剪切,但对GRP78和CHOP基因表达调控没有明显作用,表明21#对IRE1a-XBP1通路的抑制具有选择性。 另外我们发现化合物17#可抑制TM和2-DG诱导的GRP78和CHOP mRNA水平的上调,是个广谱UPR抑制剂。2-DG是葡萄糖类似物,具有一定抗肿瘤效应,但效果不佳。17#可抑制由2-DG (2-Deoxy-D-Glucose)诱导的UPR相关因子的上调,可同2-DG共同作用引起Hela细胞周期阻滞,增强对细胞增殖的抑制作用。在Hela细胞中过表达GRP78可部分逆转2-DG与17#共同作用引起的细胞周期阻滞,提示2-DG激活UPR可能是抗肿瘤效果不佳的原因。 综上所述,通过XBP1-DBD-luc细胞模型和IREla核酸酶分子测活模型得到化合物21#和17#。对21#抑制IRE1a酶活特异性和选择性的机制进行研究,并确定ROS对IRE1a酶活性的抑制作用有贡献,初步提出IREla核酸酶抑制剂的新机制,为新型IRE1a核酸酶小分子抑制剂提供新的条件和思路；其次,UPR广谱抑制剂17#,可增强2-DG对肿瘤细胞生长的抑制作用,为2-DG抗肿瘤的深入和完善打下基础,也为UPR广谱抑制剂的筛选提供新的思路。
【关键词】：内质网应激 未折叠蛋白应答 IRE1α/XBP1 ROS 2-DG
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 前言13-30
• 1.1 内质网应激13-14
• 1.2 IRE1α—最保守的UPR感受器14-16
• 1.3 IRE1α-XBP1与疾病16-23
• 1.3.1 IRE1α-XBP1与肿瘤16-21
• 1.3.2 IRE1α-XBP1与代谢疾病21
• 1.3.3 IRE1α-XBP1其他一些相关疾病21-23
• 1.4 IRE1-XBP1通路调节剂的研究现状23-25
• 1.4.1 IRE1α-XBP1抑制剂23-24
• 1.4.2 IRE1α-XBP1激活剂24-25
• 1.5 内质网与氧化应激25-27
• 1.6 IRE1α-XBP1反应内质网应激状态27-28
• 1.7 论文研究目的与总体设计28-30
• 第二章 基于IRE1α-XBP1通路调节剂的筛选以及小分子化合物21#和17#的发现30-44
• 1 实验材料30-32
• 2 实验方法32-37
• 2.1 IRE1α核酸酶底物的设计32-33
• 2.2 IRE1α核酸酶活性测定体系及注意事项33-34
• 2.3 细胞培养34
• 2.4 细胞水平化合物筛选步骤34-35
• 2.5 RNase A测活体系35
• 2.6 Luciferase酶活测定35
• 2.7 RT-PCR35-37
• 2.8 实时荧光定量PCR(Q-PCR)37
• 2.9 数据处理与系统指标37
• 3 实验结果37-42
• 3.1 细胞水平筛选获得28个UPR小分子调节剂37-38
• 3.1.1 初筛37-38
• 3.1.2 复筛38
• 3.2 评价候选化合物分子水平对IRE1α核酸酶活性及细胞水平对XBP1剪切的影响38-41
• 3.2.1 候选化合物分子水平对IRE1α核酸酶活性的影响38-40
• 3.2.2 RT-PCR评价候选化合物在细胞水平对XBP1剪切的影响40-41
• 3.3 分子和细胞水平考察化合物作用的选择性41-42
• 3.3.1 IRE1α核酸酶抑制剂对RNase A活性的影响41
• 3.3.2 细胞水平评价28个有效化合物对IRE1α-XBP1通路影响的选择性41-42
• 4 讨论与总结42-44
• 第三章 21#抑制IRE1α核酸酶活性的作用机制研究44-59
• 1 实验材料44
• 2 实验方法44-47
• 2.1 IRE1α激酶分子测活方法(HTRF)介绍44-45
• 2.2 激酶测活体系45-46
• 2.3 IRE1α核酸酶活性测定46
• 2.4 ROS检测46
• 2.5 细胞培养46
• 2.6 RT-PCR和western blot46-47
• 2.7 数据处理与系统指标47
• 3 实验结果47-56
• 3.1 星形孢菌素(STS)对IRE1α激酶活性的影响47
• 3.2 细胞水平21#对IRE1α酶活性的影响47-48
• 3.3 分子水平21#对IRE1α激酶活性的影响48-49
• 3.4 21#对IRE1α酶活性的抑制与孵育时间的关系49-50
• 3.5 DTT不同浓度对21#发挥酶活抑制作用的影响50-52
• 3.6 检测DTT与21#反应是否产生活性氧(ROS)52-53
• 3.7 检测ROS部分清除后21#对IRE1α核酸酶活性的影响53-54
• 3.8 H_2O_2和zhang400-1对IRE1α酶活性的影响54-56
• 3.9 质谱鉴定IRE1α可被氧化的保守半胱氨酸位点56
• 4 讨论与总结56-59
• 第四章 IRE1α-XBP1非选择性抑制剂17#及其改造系列化合物的抗肿瘤活性与作用机制研究59-71
• 1 实验材料60
• 2 实验方法60-62
• 2.1 RT-PCR,western blot,Q-PCR60-61
• 2.2 MTS法检测细胞活率61
• 2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期61-62
• 2.4 数据处理与系统指标62
• 3 实验结果62-69
• 3.1 17#对UPR下游因子转录水平的影响62-64
• 3.2 17#与2-DG共同作用抑制肿瘤细胞生长64-65
• 3.3 17#与2-DG共同作用引起细胞周期阻滞65-66
• 3.4 17#与2-DG的共同作用效应与UPR相关66-67
• 3.5 17#及其改造化合物的相关评价67-69
• 4 总结及待解决的问题69-71
• 参考文献71-75
• 附录75-76
• 缩略语检索表76-78
• 致谢78-79

【共引文献】

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本文编号：544410