抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6单克隆抗体制备及鉴定

发布时间：2017-07-15 14:09

  本文关键词：抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6单克隆抗体制备及鉴定

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【摘要】：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae, Hi)是广泛存在于健康人呼吸道的条件致病菌,可分为荚膜型和无荚膜型两类,荚膜型包括a-f共6个血清型,无荚膜型又称为不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae, NTHi)。Hi感染十分普遍,可引起脑膜炎、肺炎、关节脓肿等多种疾病,其临床表现严重而缺乏独特性,因此早期、快速的病原学检测对Hi感染的诊断和治疗都具有非常重要的意义。目前我国临床实验室对Hi的检测以培养法为主,其次有血清学方法与各种聚合酶链反应。相比较而言,血清学方法操作简便、敏感性高、无需特殊仪器,具较高的临床实用价值,但目前所用抗体试剂基本依赖进口,价格昂贵,制约了它的使用。本研究旨在获得理想的小鼠抗Hi单克隆抗体杂交瘤细胞株,以制备大量高纯度的Hi单克隆抗体,为改善Hi抗体试剂依赖进口的局面和进一步开发更准确、快速的血清学诊断方法而打下基础。P6蛋白是一种有荚膜和无荚膜的不可分型Hi菌株中均存在的重要外膜蛋白,遗传上具有高度的保守性,而相对于其它种类细菌又具有高度的特异性,因此,确定以P6蛋白作为制备单克隆抗体的特定免疫原。实验过程如下： 复苏并扩增基因工程重组菌BL21(pGEX-6p-2-P6),按照实验室确定的表达条件诱导融合蛋白GST-P6表达,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析证实结果与预期一致；利用谷胱甘肽微珠对融合标签GST的吸附作用纯化重组蛋白,以分光光度计测定纯化液的吸光度,计算出GST-P6蛋白的含量约为958μg·mL-1。 取纯化的GST-P6与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后腹腔免疫BALB/c小鼠,剂量为每只50μg；以后每隔2周,用相同剂量的免疫原和等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔免疫,连续2次；间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清抗P6蛋白抗体滴度,有3只小鼠的抗体滴度达到1：10000以上；选择滴度高者腹腔注射同等剂量不含佐剂的重组蛋白加强免疫1次,3d后进行融合。 按常规程序留取免疫小鼠血清并制备脾细胞与SP2/0细胞,加入聚乙二醇(PEG1500)进行融合；以经甲醛固定的标准Hi菌体和纯化重组蛋白GST-P6分别作为检测抗原,通过方阵实验确定抗原最佳包被浓度、阳性与阴性血清最佳稀释度等,建立间接ELISA法用于筛选杂交瘤细胞；用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,共获得2株抗P6蛋白单克隆抗体(McAb)细胞株,分别命名为α2G3和y2C4. 经培养上清液检测,证实α2G3和y2C4两株细胞在连续培养、多次传代及冻存复苏后均能稳定分泌抗P6蛋白单克隆抗体；细胞培养上清液最高滴度分别为1：256和1：512.核型分析显示杂交瘤细胞株α2G3的染色体众数为103条,y2C4为95条,特征性的中间着丝粒染色体各为1条,符合融合细胞的特征。通过细胞数量、单抗产量等的观察,推定a2G3的细胞周期约为4-5天。 以胶体金单克隆抗体试带鉴定α2G3为IgG2b, y2C4为IgM,两者均为Kappa型。间接ELISA检测表明2种单抗可能识别P6蛋白不同表位；均只与标准或临床分离的Hi菌株起反应,而与绿脓杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌等均不反应,具有良好的特异性；检出Hi标准株的最低包被浓度为每孔6.25×103个细菌,敏感性也较高。 本研究成功地制备了2株可稳定产生抗Hi外膜蛋白P6单克隆抗体的杂交瘤细胞株,获得了2种具有良好敏感性与特异性、可结合不同P6抗原表位的单克隆抗体,为进一步研究和开发更准确、快捷的Hi临床检测方法奠定了基础。
【关键词】：流感嗜血杆菌 外膜蛋白P6 杂交瘤 单克隆抗体 间接酶联免疫吸附试验
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 英文缩写9-11
• 前言11-13
• 实验仪器与材料13-18
• 实验方法和步骤18-26
• 结果26-30
• 附图30-35
• 附表35-40
• 讨论40-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 综述50-65
• 参考文献60-65
• 致谢65-66
• 个人简历66-67

【参考文献】

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本文编号：544239