四株CoxA16病毒免疫原性及毒株间交叉保护的比较分析

发布时间：2017-07-16 02:16

  本文关键词：四株CoxA16病毒免疫原性及毒株间交叉保护的比较分析

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【摘要】：柯萨奇A型16病毒(Coxsackievirus group A16,CA16)属于小RNA病毒科肠道病毒属成员,是导致手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的两大主要病原体之一。以往的研究认为柯萨奇A型16病毒感染人体后常常会表现出无临床症状出现或感染后很少出现重症病例的感染方式,因此人们对其并没有太多的深入研究。近年来关于CA16感染所致HFMD的报道已显示在防控手足口病的工作中要加深对CA16研究的重要性,尤其是在某些地区的HFMD重症病例中由CA16所引起的比例可以占到20%以上,提示我们其致病性愈来愈引起了人们的关注,对CA16的病原学和免疫学特征的探索已经成为样子疫苗的重要实验基础。本研究通过对近年来我国CA16分离株进行基因分型,分析CA16在我国流行的基本分子遗传学信息。选取出4个来自于中国大陆不同地区的CA16毒株,制备纯化灭活全病毒颗粒,免疫小鼠后研究其在免疫原性和毒株间的交叉抗原方面的特性及差异,以期这些研究结果为以后研发全病毒灭活颗粒CA16病毒疫苗提供一定的实验研究基础。 本研究以CA16病毒中的VP1核苷酸序列为依据对19株CA16病毒建立种系进化树并进行基因分型后,了解到我国大陆地区现流行的不同CAl6毒株跟于1951分离出的第一株CA16病毒(国际标准株G10)在分子遗传学上均产生了较大的变化。同时,从CA16的种系进化树中可以看出我国大陆地区2000年前所流行的CA16毒株在基因型上属于B1基因型,而在2000-2010这10年间则又经历了B2a到B2b基因型的变化,并且2008-2010年的分离株大部分属于B2b基因型。同时,我们注意到不同的毒株间在核苷酸序列及编码蛋白氨基酸序列上均存在一定的差异,这提示了我们不同的CA16毒株在抗原表型上也会产生一定的差异。因此我们选择了G20、MY08、KM208和KMM/08这四个来自于中国大陆不同地区的CA16毒株,研究它们在毒株本身的免疫原性及毒株间交叉抗原的差别。这四个毒株均分离于2008-2010年间,其中除了KMM/08为B2a基因型外,其他三个毒株均为B2b基因型。 在制备抗原时我们将福尔马林灭活后的CA16病毒通过截留量为100kDa的切向流过滤装置进行浓缩40倍后,用AKTA purifier层析纯化系统进行层析纯化,纯化后的样品经ELISA检测样品中的病毒抗原。纯化好的抗原均以640EU/只的抗原量免疫BALB/c雌性小鼠,每组6只。研究中我们通过Western Blotting的方法验证了CA16免疫血清中的中和抗体可以识别CA16病毒中的结构蛋白VP1和VP2。 在随后对这四株CA16毒株本身的免疫原性进行比较分析时,我们发现G20、KMM/08和KM208这三个毒株纯化后的灭活病毒颗粒免疫小鼠后均能显示出较好的免疫原性,显著性优于MY08毒株(P0.05)。我们知道可以诱导机体产生中和性抗体的主要中和抗原表位位于VP1上,因此我们对这四个毒株VP1的氨基酸序列进行了比对分析,结果表明G20、KMM/08和KM208这三个毒株在VP1蛋白氨基酸序列上完全一致,而MY08毒株则跟这三个毒株在VP1蛋白氨基酸序列上存在三个差异氨基酸位点。通过进一步的分析我们发现MY08毒株在VP1上第102位氨基酸位点的突变(N→D)属于中性氨基酸突变为酸性氨基酸,并且这个突变位点正好发生于VP1第94-108位氨基酸肽段(TMPTTGTGTGTGNTDGYVN)的一个保守型线性中和抗原表位上。另外,第102位氨基酸由N→D的突变也可使该抗原表位的亲和力下降。以上信息提示MY08毒株与其他毒株相比显示出了较弱的免疫原性可能与该区域的突变有关。 在毒株间交叉抗原保护性的研究中,实验结果表明这四个毒株间都存在着不同程度的交叉保护作用。通过交叉中和试验测定它们之间的交叉中和抗体效价后发现G20、KMM/08和KM208这三个毒株对其他毒株的交叉保护性优于MY08对其他毒株的交叉保护性,但差异不具有统计学意义(P0.05),这跟MY08本身较弱的免疫原性存在一定的关系。另外,G20、KMM/08和KM208这三个毒株对MY08毒株的交叉中和保护效价要低于它们三者彼此间的交叉中和保护效价,造成这现象产生的可能原因是MY08毒株VP1上发生氨基酸位点突变的保守性抗原表位影响到了其与其他毒株对应的中和抗体的识别和结合,从而不能有效地中和CA16病毒。
【关键词】：Cox.A16病毒 免疫原性 交叉保护 序列分析 基因分型
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-14
• 一、实验材料与方法14-30
• (一) 实验材料14-19
• (二) 实验方法19-30
• 二、实验结果与分析30-39
• 三、讨论39-45
• 四、小结45-46
• 参考文献46-50
• 论文综述50-56
• 参考文献53-56
• 附录一 主要缩略词表56-58
• 附录二 主要溶液配制58-63
• 致谢63-64
• 研究生简历64-65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：546716