小鼠诺如病毒检测方法的研究

发布时间：2017-07-15 21:34

  本文关键词：小鼠诺如病毒检测方法的研究

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【摘要】：实验动物的质量与动物实验能否顺利进行关系非常密切,我国要求实验用SPF级小鼠必须排除的病毒有11种,尽管如此仍然会因为动物本身携带的微生物而干扰实验结果。小鼠诺如病毒(Murine Norovirus, MNV)就是从意外死亡的实验小鼠中分离得到,免疫缺陷小鼠感染这种病毒后发生炎症反应甚至死亡。我国关于小鼠诺如病毒的报道还比较少,其致病力及对实验研究的影响尚不完全清楚,也没有明确的感染情况调查。 本研究以实现快速、准确、高效的MNV检测为目的,分别建立了MNV检测的PCR方法,实时荧光定量PCR方法,间接免疫荧光试验法和酶联免疫吸附试验法,并对北京市实验小鼠MNV感染情况进行调查,具体工作如下： 1、MNV标准化检测技术的建立 (1)一步法RT-PCR方法：通过对MNV全基因组序列分析,设计最适的扩增引物并对其优化,对反应体系及反应条件进行优化,使体系的灵敏度最优化,最终确定反应体系为引物浓度0.3μmol/L, Mg2+浓度1.5mmol/L时,该方法的灵敏度可达到103拷贝；(2)两步法实时荧光定量qPCR方法：优化并评价了反应条件,最终确定反应体系中引物浓度0.3μmol/L,探针浓度03μmo1/L,以Ct值为35作为检测限,该方法的灵敏度可达到几个拷贝数；(3)间接免疫荧光分析方法：以全病毒作为抗原。严格控制抗原玻片的阳性细胞量,优化抗原玻片制作过程,该方法检测的80份血清中,IFA法测定阳性27份,阴性53份,检测符合率为96.0%；(4)酶联免疫吸附试验方法：以重组蛋白VP1为抗原,棋盘法确定抗原浓度和待检血清最佳稀释度,其灵敏度高于商品化的ELISA试剂盒且与其他抗原之间无交叉反应。 2、北京市实验小鼠MNV感染情况调查。 本研究随机选择了2007年-2013年中的600份来自不同设施的实验小鼠血清,分别采用间接免疫荧光分析方法和建立了酶联免疫吸附试验方法对其进行检测,基于本实验结果,这六年中不同年份的不同实验设施中均检出实验小鼠感染MNV的情况,此外,大多数MNV阳性样本来自实验设施(69/223)。动物供应商提供的样品中仅有1例检测为MNV阳性(1/377)。基于当前分析,MNV在北京地区的实验设施实验小鼠中的感染率较高。
【关键词】：小鼠诺如病毒 聚合酶链式反应 免疫荧光试验 酶联免疫吸附试验
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R373
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-7
• 第一部分 前言7-16
• 1.1 病原学7-8
• 1.2 分子生物学8-10
• 1.3 检测方法10-12
• 1.4 预防和控制12-13
• 1.5 本论文的研究目的及意义13-14
• 1.6 前景与展望14-16
• 第二部分 材料与方法16-29
• 2.1 材料16-20
• 2.2 方法20-29
• 第三部分 研究结果29-47
• 3.1 RNA抽提方法的优化29-31
• 3.2 一步法RT-PCR反应体系体系的优化31-33
• 3.3 两步法实时荧光定量RT-PCR的建立及优化33-34
• 3.4 IFA方法的建立及优化34-40
• 3.5 ELISA方法的建立及优化40-44
• 3.6 北京地区实验小鼠感染MNV情况的调查结果44-47
• 第四部分 讨论47-50
• 第五部分 小结50-51
• 参考文献51-57
• 附录1：小鼠诺如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)玻片抗原制备作业指导书57-60
• 附录2：小鼠诺如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)免疫荧光法检测作业指导书60-63
• 附录3：小鼠诺如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)酶联免疫吸附法检测作业指导书63-66
• 附录4：小鼠诺如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)RNA一步法RT-PCR检测作业指导书66-69
• 附录5：小鼠诺如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)cDNA Real-Time qPCR检测作业指导书69-71
• 附录6：英文缩写71-72
• 致谢72-73

【参考文献】

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1 田胜男;刘云波;;鼠诺如病毒概述[J];中国比较医学杂志;2013年07期

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本文编号：545896