Th17细胞在蛔虫抗原诱导肿瘤细胞凋亡作用机制的探讨

发布时间：2017-07-17 13:03

  本文关键词：Th17细胞在蛔虫抗原诱导肿瘤细胞凋亡作用机制的探讨

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【摘要】：目的： 探讨Th17细胞在蛔虫抗原诱导的人肺腺癌细胞（A549）凋亡中的作用机制。 方法： 1、蛔虫抗原诱导细胞凋亡 （1）蛔虫抗原的制备：将人蛔虫虫体制成匀浆，经10,000rpm离心30min，去除组织糜沉淀及大分子蛋白，取上清过0.4μm滤膜除菌，用核酸/蛋白分析仪检测其蛋白浓度，并排除内毒素污染后，分装后置-30℃冻存备用。 （2）肿瘤细胞株的培养：A549细胞常规复苏后，用含10%FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。待细胞至对数生长期时用0.25%的胰蛋白酶消化传代。 （3）细胞活性检测：取对数生长期A549细胞，经0.25%的胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，加入96孔板，每孔10,000个细胞，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养4h，然后加入不同浓度蛔虫抗原分别培养18h和24h，加入10μlCCK-8,培养2-3h，酶标仪检测OD450值。根据OD450值确定抗原作用浓度及时间。 2、细胞凋亡和周期的检测 （1）T细胞制备和鉴定：取健康人全血用淋巴细胞分离液分离，吸取淋巴细胞层后用无血清RPMI1640洗涤2次，用含5%FBS的RPMI1640重悬细胞，过尼龙毛柱。过尼龙毛柱后的细胞加入相对应量的anti-CD3FITC、anti-CD4APC、anti-CD8PE、anti-CD45PerCP避光孵育15min，，流式检测T细胞纯度，CD3、CD4以及CD3+CD8+表达为T细胞。 （2）细胞凋亡率检测：A549细胞组和A549细胞+T细胞共培养组培养4h后，加入不同浓度的蛔虫抗原（25μg/ml、125μg/ml、500μg/ml）分别作用1h、18h、24h后收集细胞。用4℃预冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入1.25μl AnnexinV-FITC，常温避光孵育15min后离心，加入PI10μl,上流式细胞仪检测。 （3）细胞周期检测：细胞培养4h后，加入125μg/ml的蛔虫抗原与A549细胞作用18h后，收集细胞，预冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，70%乙醇4℃固定过夜，加入300μl配制备好的染液避光孵育30min，上流式细胞仪检测。 3.细胞因子表达的检测 （1）实验分组：实验分为5组，分别为组①：A549细胞+培养基；组②：A549细胞+T细胞；组③：A549细胞+蛔虫抗原；组④：蛔虫抗原+T细胞；组⑤：A549细胞+蛔虫抗原+T细胞。蛔虫抗原分别设定低、中、高三个剂量浓度。 （2）Transwell小室共培养：组②A549细胞+T细胞和组⑤A549细胞+蛔虫抗原+T细胞采用Transwell小室共培养体系，将上室加入T细胞下室加入A549细胞T细胞、A549细胞密度比为15:1。使细胞之间自身并不接触，而细胞之间的影响只通过细胞因子之间的传递。 （3）ELISA检测细胞因子：收集各实验组细胞上清，使用ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6、IL-17、IL-23和TGF-β。 （4）荧光定量PCR：分别提取各组细胞的总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNAs，用Applied Biosystems7500Real-Time PCR System检测cDNAs特异性引物IL-6、IL-17、IL-23和TGF-β mRNA表达。用SYBR Premix Ex Taq I kit检测目的产物，实时PCR反应体系为：95℃、30S；（95℃、5S；60℃、34S）×40个循环95℃、15S；60℃、1min；95℃、15S。计算相对表达值。 4.数据处理 统计学分析：采用SPSS19.0统计软件进行分析。独立实验的数据采用Mean±SD表示，小样本数据采用Lg10转换，实验组与对照组的组间差异比较采用one-way ANOVA与t检验分析，P0.05为差异具有统计学意义。 结果： 1、细胞毒性检测：取细胞存活率大于50％为诱导实验的浓度。蛔虫抗原浓度为125μg/ml时，细胞抑制率34%，为所有作用浓度最高，且与阴性对照组比较有显著性差异（P0.01）。故取蛔虫抗原低、中、高浓度分别为25μg/ml、125μg/ml、500μg/ml。 2、细胞凋亡率检测：蛔虫抗原125μg/ml浓度处理组在18h时，细胞早期凋亡率（37.801.70）%显著高于对照组（7.250.50）%；而与T淋巴细胞共培养的蛔虫抗原125μg/ml浓度处理组在18h时，细胞早期凋亡率则由（37.801.70）%下降到（7.200.57）%。 3、A549细胞周期检测：蛔虫抗原125μg/ml浓度处理组在18h时，细胞周期G1/S占8.18，显著高于阴性对照G1/S的4.57。 4、细胞因子表达检测： 1) ELISA检测：在同一时间段内，当蛔虫抗原浓度增加时，除TGF-β外，其他细胞因子的表达水平都随着浓度的增加而升高，且都有显著性差异（P0.05）。在同一浓度下，除TGF-β外，其他细胞因子的表达水平都随着蛔虫抗原作用时间的延长而降低，存在显著性差异（P0.05）。TGF-β则在各时间段和各浓度区间内无明显趋势。 2)荧光定量PCR：各实验组A549细胞的IL-6、IL-17和TGF-β mRNA水平都在18h达到高峰，且都与空白对照组存在差异性（P0.05）。各实验组T淋巴细胞的IL-6、IL-17、IL-23和TGF-β mRNA水平也在同一作用时间段达到最高，且与对照组存在差异性（P0.05）。 结论： 1.蛔虫抗原诱导A549细胞凋亡阻滞在G1期。 2.蛔虫抗原能够刺激T细胞IL-17和IL-23表达水平增高使Th17活化。 3.蛔虫抗原诱导的A549细胞凋亡与Th17细胞的分化有关。 4.随着蛔虫抗原作用时间延长TGF-β表达无明显趋势，而IL-6升高，IL-17和IL-23表达水平降低，导致Th17细胞的分化受阻，细胞凋亡被抑制。
【关键词】：蛔虫抗原 T淋巴细胞 Th17细胞 A549细胞 凋亡 IL-6 IL-17 IL-23 TGF-β
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文缩写一览表12-13
• 第1章 引言13-16
• 1.1 感染和肿瘤与细胞因子的关系13-14
• 1.2 Th17 细胞的特性及研究进展14-16
• 第2章 材料与方法16-27
• 2.1 实验动物、试剂与设备16-18
• 2.1.1 实验动物及细胞株16
• 2.1.2 主要的实验试剂16
• 2.1.3 主要的实验设备16-17
• 2.1.4 主要的试剂配制17-18
• 2.2 实验方法18-27
• 2.2.1 蛔虫抗原的制备18
• 2.2.2 体外培养肿瘤细胞株18
• 2.2.3 实验分组18
• 2.2.4 Transwell 培养18
• 2.2.5 CCK8 检测18-19
• 2.2.6 T 淋巴细胞制备19
• 2.2.7 T 淋巴细胞的鉴定19-20
• 2.2.8 细胞凋亡率的检测20
• 2.2.9 FCM 检测细胞周期20-21
• 2.2.10 ELISA 法检测细胞因子21-22
• 2.2.11 荧光定量 PCR 分析 IL-6、TGF-β、IL-17 和 IL-23 mRNA 的相对表达水平22-26
• 2.2.12 统计学分析26-27
• 第3章 结果27-40
• 3.1 蛔虫抗原的制备27
• 3.2 细胞毒性检测27
• 3.3 FCM 法检测 T 淋巴细胞表面分子的表达27-28
• 3.4 FCM 检测蛔虫抗原对 A549 细胞凋亡的影响28-29
• 3.5 FCM 检测蛔虫抗原对 A549 细胞周期的影响29
• 3.6 ELISA 检测 Th17 细胞相关细胞因子表达29-35
• 3.6.1 ELISA 检测 IL-6 表达水平变化29-31
• 3.6.2 ELISA 检测 TGF-β表达水平变化31-32
• 3.6.3 ELISA 检测 IL-17 表达水平变化32-34
• 3.6.4 ELISA 检测 IL-23 表达水平变化34-35
• 3.7 荧光定量 PCR 分析 IL-6、TGF-β、IL-17 和 IL-23 mRNA 的相对表达水平35-40
• 3.7.1 荧光定量 PCR 分析 IL-6 mRNA 的相对表达水平水平变化36-37
• 3.7.2 荧光定量 PCR 分析 TGF-β mRNA 的相对表达水平水平变化37-38
• 3.7.3 荧光定量 PCR 分析 IL-17 mRNA 的相对表达水平水平变化38-39
• 3.7.4 荧光定量 PCR 分析 IL-23 mRNA 的相对表达水平水平变化39-40
• 第4章 讨论40-46
• 4.1 Th17 细胞与蛔虫抗原诱导 A549 细胞凋亡40-41
• 4.2 蛔虫抗原对 A549 细胞周期的影响41
• 4.3 炎性细胞因子 IL-6 和 TGF-β的表达水平41-43
• 4.4 Th17 细胞相关细胞因子 IL-17 和 IL-23 的表达水平43-46
• 第5章 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-51
• 附录51-53
• 攻读学位期间的研究成果53-54
• 综述54-59
• 参考文献57-59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 田晶;巴彩凤;;小鼠感染猪附红细胞体后Th17相关因子的实验研究[J];中国人兽共患病学报;2011年03期

2 祝伟;黄川;黄艳琴;胡银英;戴志芳;袁芳;袁铿;;负载人蛔虫和猪蛔虫抗原树突状细胞影响T细胞亚群活性研究[J];中国人兽共患病学报;2013年08期

本文编号：553686