PLIγ重组表达载体构建及其抗LPS诱导的THP-1细胞炎症作用

发布时间：2017-07-19 18:39

  本文关键词：PLIγ重组表达载体构建及其抗LPS诱导的THP-1细胞炎症作用

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【摘要】：分泌型磷脂酶A2（Secretory Phospholipase A2,sPLA2）是花生四烯酸（AA）代谢通路的上游关键酶，sPLA2的激活导致AA水平升高，进而产生更多的炎症介质，例如前列腺素、白三烯、血栓烷A等。因此，sPLA2的高表达可导致多种炎性疾病，例如胰腺炎、风湿性关节炎、肿瘤、动脉粥样硬化等，sPLA2也是以上多种疾病药物治疗的重要靶点。 自然界中sPLA2在蛇毒中分泌最为广泛，蛇毒中毒患者也常有全身炎症反应综合症（SIRS）和组织坏死的症状。我们实验室前期从华游蛇（Sinonatrixannularis）——一种中国的无毒蛇中，分离到蛇毒sPLA2(svPLA2)的γ型抑制蛋白（phospholipae A2inhibitor, PLIγ）。前期研究中，我们发现这种PLIγ有良好的抗蛇毒PLA2出血毒作用。此外，与蛇毒PLA2与人sPLA2结构高度相似，分类上属于相同的亚型。因此，PLIγ能否阻断人类sPLA2，并可能对花生四烯酸（AA）介导的炎症发挥抑制作用，这个问题引起了我们的研究兴趣。鉴于此，我们克隆了PLIγ基因，并将其导入THP-1细胞中，评价PLIγ对LPS诱导的人THP-1细胞炎症的作用。 目的： 为了研究体内PLIγ在细胞水平的抗炎症作用，我们构建PLIγ重组表达载体并转染人THP-1细胞，检测细胞中sPLA2亚型，从而阐明其与炎症反应相关的sPLA2亚型，同时检测一些典型的促炎因子如AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF表达水平，通过LPS诱导的THP-1细胞，探讨PLIγ的抗炎活性。 方法： 设计分别含有EcoRI，BamHI酶切位点的上下游引物，通过RT-PCR克隆华游蛇PLIγ基因。PCR产物和pIRES2-EGFP载体经过酶切、凝胶回收和T4酶连接，构建pIRES2-EGFP-PLIγ重组表达载体，将其转化入DH5α菌保存，通过EcoRI，BamHI双酶切鉴定重组载体。重组载体通过脂质体法转染人THP-1细胞，于显微镜下观察GFP绿色荧光的表达，评价转染效率。 由于转染效率较低，且重组质粒在THP-1细胞有丝分裂过程中容易丢失，，因此，该质粒不适合后续的功能试验。为了保证PLIγ在THP-1的稳定表达，我们转而采用慢病毒载体系统。我们将PLIγ基因与含有3个Flag序列的标签融合表达，生成慢病毒载体PGC-FU-PLIγ-EGFP。将该重组病毒载体转染293T细胞，获得有感染能力的重组慢病毒LV-PLIγ-EGFP。重组蛋白PLIγ-3Flag的表达情况由western blot检测。 将病毒LV-PLIγ-EGFP感染THP-1细胞，通过GFP荧光率评价感染效率。THP-1细胞分为三组：正常细胞组（control组）、PLIγ阴性组（该组仅转染LV-EGFP，也称mock组）、PLIγ阳性组（该组转染LV-PLIγ-EGFP，也称PLIγ组）。实验时，将1μg/ml LPS孵育各组THP-1细胞，同时设置与各组相对应的不加LPS的平行组。Real-time PCR方法检测各组细胞中sPLA2各亚型，采用ELISA法检测AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF等炎症因子表达水平，WST-1法研究各组THP-1细胞的增殖。 结果： 成功构建了pIRES2-EGFP-PLIγ的真核表达质粒，但由于该质粒的转染效率和稳定性都较低，不能满足后续功能试验要求。通过荧光显微镜观察和Western blot检测，本文构建的慢病毒系统能高效、稳定地表达GFP绿色荧光和PLIγ。 在LPS诱导THP-1细胞炎症过程中，我们发现两种sPLA2亚型（IIF和X）及六种炎症因子表达显著上调。相对于正常组THP-1细胞，病毒转染组（PLIγ组和mock组）细胞炎症因子表达量更高。更重要的是，PLIγ组相对于mock组，其六种炎症因子的表达水平更低。WST-1实验发现，相对于正常组THP-1细胞，病毒转染组（PLIγ组和mock组）细胞增殖速度略慢，不过PLIγ组相对于mock组细胞增殖速度略快。 结论: 重组慢病毒系统可以稳定、高效地表达异源基因，如本文中的PLIγ基因。PLIγ的存在可以显著降低AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF等六种炎症因子表达。由于IIF和X型sPLA2在LPS诱导的THP-1细胞中表达上调，说明PLIγ很可能是通过抑制这两种sPLA2的激活而发挥抗炎症作用。此外，PLIγ不会影响细胞的增殖。
【关键词】：分泌型磷脂酶A2 PLIγ 慢病毒感染 THP-1细胞 抗炎症
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英缩略词表10-11
• 第1章 引言11-14
• 1. sPLA_2与炎症11-12
• 2. PLIγ与抗炎12-13
• 3. 本文研究目的13-14
• 第2章 华游蛇 PLIγ真核表达载体构建及细胞转染14-24
• 1. 材料、试剂和仪器14-16
• 2. 实验方法16-20
• 2.1 PCR克隆华游蛇 PLI 基因16-17
• 2.2 构建 TA克隆质粒 pGEM-T/PLIγ17-18
• 2.3 构建重组质粒 pIRES2-EGFP-PLIγ18-19
• 2.4 pIRES2-EGFP-PLIγ转染 THP-1 细胞19-20
• 3 结果与分析20-22
• 3.1 华游蛇 PLIγ的扩增与电泳鉴定20-21
• 3.2 重组质粒 pIRES2-EGFP-PLIγ的酶切产物鉴定21
• 3.3 重组质粒 pIRES2-EGFP-PLIγ测序鉴定21-22
• 3.4 细胞转染结果22
• 4 小结与讨论22-24
• 第3章 慢病毒重组载体 PGC-FU-PLIγ-EGFP 的构建及病毒感染 THP-1 细胞24-34
• 1 材料试剂和仪器24-25
• 2 实验方法25-28
• 2.1 PGC-FU-PLIγ-EGFP 重组质粒的构建、扩增和鉴定25-26
• 2.2 慢病毒 LV-PLIγ-EGFP 表达检测26-27
• 2.3 慢病毒 LV-PLIγ-EGFP 感染 THP-1 细胞27-28
• 3 结果与分析28-32
• 3.1 慢病毒重组载体 PGC-FU-PLIγ-EGFP 鉴定结果28-30
• 3.2 慢病毒载体 PGC-FU-PLIγ-EGFP 中 PLIγ表达情况30-31
• 3.3 病毒 LV-PLIγ-EGFP 感染 THP-1 效率观察31-32
• 3.4 THP-1 细胞中 PLIγ表达稳定性32
• 4 讨论32-34
• 第4章 PLIγ抑制 LPS 诱导的 THP-1 细胞炎症作用34-47
• 1. 材料试剂和仪器34
• 2. 实验方法34-38
• 2.1 LPS 诱导 THP-1 细胞炎症实验34-35
• 2.2 Real-time PCR方法检测 sPLA_2抑制水平35-36
• 2.3 ELISA 方法检测 THP-1 细胞上清中各类炎症因子的含量36-37
• 2.4 LPS 诱导及 PLIγ对 THP-1 细胞增殖的影响37
• 2.5 统计处理37-38
• 3. 结果与分析38-43
• 3.1 THP-1 细胞 sPLA_2亚型表达情况38
• 3.2 Real timePCR 检测 sPLA_2-IIF 和 sPLA_2-X 表达38-40
• 3.3 PLIγ对 THP-1 细胞分泌炎症因子的影响40-41
• 3.4 LPS 诱导及 PLIγ对 THP-1 细胞增殖的影响41-43
• 4. 讨论43-47
• 4.1 人类炎症相关的 sPLA_243-44
• 4.2 sPLA_2与相关炎症因子44-45
• 4.3 特异性的 sPLA_2抑制剂45-47
• 第5章 全文总结47-48
• 结论与下一步工作计划48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-54
• 攻读学位期间的研究成果54-55
• 综述55-65
• 参考文献62-65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 钟立鹏;郭薇;姚敏;沈婷;杨武;黄春洪;;华游蛇PLIγ模拟肽的设计与活性验证[J];基础医学与临床;2014年03期

2 杨武;郭薇;黄春洪;;分泌型磷脂酶A_2亚家族:结构与功能[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年10期

本文编号：564319