日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗的构建及免疫应答的动态观察

发布时间：2017-07-20 13:00

  本文关键词：日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗的构建及免疫应答的动态观察

  更多相关文章： 日本血吸虫 重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗 构建 免疫应答 动态观察

【摘要】：目的 日本血吸虫病是由日本血吸虫（Schistosoma japonicum, Sj）引起的一种危害人体健康的地方性人兽共患寄生虫病。由于该病危害大，因此研发有效的疫苗防治该病已是势在必行。本研究拟构建Sj重组两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum，Bb)(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗，并研究其免疫BALB/c小鼠后免疫应答的动态变化，以期为Sj的免疫预防提供一条新途径。 方法 从我室保存的BL21(DE3)(pET28α-Sj26GST-Sj32)重组菌中抽提质粒pET28α-Sj26GST-Sj32，PCR扩增Sj26GST-Sj32融合基因，将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中，构建重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32。将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中，抽提质粒并进行双酶切，鉴定载体片段及目的基因片段长度。用电穿孔法将重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32转化至Bb，构建Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗，抽提质粒进行PCR鉴定。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导后以SDS-PAGE及Western-blot对表达产物进行鉴定。 将96只BALB/c小鼠随机分为2组，每组48只，用重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗分别经口服灌胃和鼻腔粘膜两种途径免疫小鼠，在免疫后0～22周每两周两组分别剖杀4只小鼠，分离血清，ELISA法测定血清抗体及细胞因子；取脾并分离脾细胞，用Sj成虫抗原（SjAWA抗原）和刀豆蛋白A（ConA）刺激培养，四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测免疫小鼠脾细胞增殖反应，同时设原液组对照；用流式细胞术（FCM）检测免疫小鼠脾CD4+和CD8+T细胞亚群的百分比；脾细胞经SjAWA抗原及ConA刺激培养，收集培养的上清液，双抗体夹心ELISA法检测脾细胞培养上清液的IL-10及IL-12水平，，设原液组（stock group）作为对照；脾细胞经ConA培养，流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率，并设原液组作为对照。 结果 PCR成功扩增出长度为1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因；双酶切证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入质粒pGEX-1λT中；PCR证实从重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗中扩增出1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因；SDS-PAGE分析显示将重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32在E.coli BL21中经IPTG诱导表达后，得到分子量约85kDa的条带，其中以5～7h处表达水平较高； Western-blot发现重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32表达产物可被Sj感染的兔血清识别。 口服免疫（per os，PO）组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分别在免疫后6、8、8、4、6、12和6周达峰值；血清IL-10和IL-12水平分别在免疫后12、6周达峰值。鼻腔粘膜（intranasal，IN）组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分别在免疫后4、2、6、2、4、8和8周达峰值；血清IL-10和IL-12水平分别于免疫后6周达峰值。PO组增殖水平于免疫后4w达高峰，而IN组于免疫后12w达高峰。PO组脾CD4+T细胞亚群于免疫后4w达最高水平，IN组CD4+T细胞亚群于免疫后12w达最高水平；PO组脾CD8+T细胞亚群于10w达峰值，IN组CD8+T细胞亚群于免疫后6w达最高水平。PO组和IN组小鼠脾细胞IL-10水平均于免疫后6w达最高；PO组小鼠脾细胞IL-12水平于免疫后6w达最高，IN组脾细胞IL-12水平于12w达最高水平。PO组小鼠脾细胞凋亡率于免疫后6w达最高，而IN组脾细胞凋亡率于12w达最高水平。 结论 成功构建日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗；该疫苗在免疫早期可诱导小鼠产生有效地Th1和Th2型混合性免疫应答。
【关键词】：日本血吸虫 重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗 构建 免疫应答 动态观察
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-18
• 参考文献17-18
• 第一章 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗构建及其表达效率18-32
• 第一节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗的构建及鉴定18-27
• 1 材料与方法18-21
• 2 结果21-23
• 3 讨论23-25
• 参考文献25-27
• 第二节 日本血吸虫重组质粒 pGEX-Sj26GST-Sj32 在大肠埃希菌 BL21(DE3)表达效率的研究27-32
• 1 材料和方法27-28
• 2 结果28-30
• 3 讨论30
• 参考文献30-32
• 第二章 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗诱导BALB/c鼠免疫应答的动态观察32-62
• 第一节 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫BALB/c鼠血清抗体及细胞因子的动态观察32-42
• 1 材料与方法32-33
• 2 结果33-36
• 3 讨论36-39
• 参考文献39-42
• 第二节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾细胞增殖的动态观察42-47
• 1 材料与方法42-43
• 2 结果43-45
• 3 讨论45
• 参考文献45-47
• 第三节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的动态观察47-52
• 1 材料与方法47-48
• 2 结果48-49
• 3 讨论49-51
• 参考文献51-52
• 第四节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾细胞因子动态观察52-57
• 1 材料与方法52-53
• 2 结果53-55
• 3 讨论55-56
• 参考文献56-57
• 第五节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾细胞凋亡的动态观察57-62
• 1 材料与方法57-58
• 2 结果58-59
• 3 讨论59-60
• 参考文献60-62
• 全文小结62-63
• 文献综述63-71
• 参考文献68-71
• 致谢71-72
• 攻读学位期间发表的论文72-73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李文桂;陈雅棠;;双歧杆菌生物学作用研究进展[J];地方病通报;2006年01期

2 郭志英,易成,王树人,王浩毅;婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统的构建[J];中国肺癌杂志;2004年02期

3 李永,曾宪芳,易新元,田明礼;应用日本血吸虫病患者血清特异性抗体亚类考核疗效[J];湖南医科大学学报;1997年05期

4 蔡春,易新元,曾宪芳,周金春,舒新华;重组日本血吸虫SjGST-Sj32蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究[J];湖南医科大学学报;1999年03期

5 王昌源,陈雅棠,余登高,黄爱龙;多房棘球绦虫ELP重组蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠引起的免疫应答[J];免疫学杂志;2003年04期

6 陈欲晓;细胞因子对血吸虫病免疫调节的研究进展[J];中国热带医学;2004年02期

7 田芳,夏超明,骆伟,龚唯,周卫芳;协同刺激分子B7-1/2对日本血吸虫感染小鼠Th1/Th2细胞因子表达水平的影响[J];热带医学杂志;2003年02期

8 赵晶晶;黄俊;麦t熡

本文编号：568079