微小RNA-214在大鼠心肌细胞氧化应激损伤中的作用及机制

发布时间：2017-07-20 13:08

  本文关键词：微小RNA-214在大鼠心肌细胞氧化应激损伤中的作用及机制

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【摘要】：目的：心血管疾病的发病率和死亡率很高，是危害人类健康的主要疾病之一，关于心血管疾病在分子学和基因学上的发病机制的研究倍受学者们的关注。研究表明微小RNA（microRNA，miRNA)在心血管的发生发育及诸如心肌肥大，心力衰竭，心肌梗死等许多心血管疾病中都扮演重要角色。 在心梗的发病过程中活性氧化物（reactive oxygen species，ROS）在梗死区及非梗死区均增加，ROS可加速心肌缺血，诱导细胞凋亡。更有许多证据表明ROS作为信号转导中介，具有激活转录因子及基因表达，促进细胞增长及凋亡的作用。H_2O_2是ROS的一种，实验中经常被用来模拟心肌缺氧损伤。许多miRNAs在H_2O_2干预后的心肌细胞中的表达变化以及miRNAs在ROS诱导的心肌细胞损伤中所起的作用都不确定。此研究旨在探讨在H_2O_2损伤的心肌细胞中miRNA-214的表达变化，证实miRNA-214在H_2O_2损伤的心肌细胞中的作用，并进一步研究人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）是否是miRNA-214调节心肌细胞凋亡的的靶基因。 方法： 1乳鼠心肌细胞的分离培养及鉴定。取出生1-3天的SD大鼠乳鼠，低温麻醉，清洗干净后开胸，取出心室肌组织剪成小块，消化液消化，直至组织消化完全，收集消化液过滤、离心、重悬后，在含有13%胎牛血清及1%青链霉素的DMEM/F12完全培养基中差速贴壁1h，更换培养瓶再加入0.1mmol/LBrdu来纯化心肌细胞。48h后更换为完全培养基，，以后每2天换一次液。坚持每天倒置显微镜下观察细胞变化。培养3天后心肌细胞呈梭形、多角形等不规则形态，伸出突起相互连接交织成网，并出现成片同步搏动，频率多为60-100次/分,3-7天细胞活力均保持较好状态，适合实验研究。 a-actin抗体免疫细胞化学染色显示：心肌细胞胞质被染成棕黄色丝状结构。心肌细胞纯度鉴定：乳鼠心肌细胞培养72h，a-actin阳性率为75%-85%。 2心肌细胞氧化应激损伤模型的建立。用H_2O_2诱导体外培养的原代心肌细胞损伤。实验分正常对照组(normal control)，H_2O_2损伤组(H_2O_2group,浓度分别为10、30、50、100、200μmol/L，作用时间为6h、12h、24h）。通过MTT比色法检测各组细胞活力，摸索H_2O_2诱导心肌细胞氧化损伤的适当浓度及时间。根据MTT摸索的心肌细胞氧化应激损伤模型的时间与浓度，实验分正常对照组(normal control)，H_2O_2损伤组(H_2O_2group,浓度分别为30、50、100、200μmol/L，作用时间为6h）。消化、离心收集细胞，Annexin V-FITC和PI染色15min后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。进一步确定H_2O_2浓度，建立心肌细胞H_2O_2氧化应激损伤模型。 3H_2O_2干预心肌细胞后观察miRNA-214表达变化。培养的大鼠心肌细胞给予H_2O_2，分空白对照组和H_2O_2干预组（浓度分别为30、50、100μmol/L)干预6h后提取细胞中的RNA，用qRT-PCR检测miRNA-214的相对表达变化。 4AnnexinV/PI方法检测不同转染组的心肌细胞经H_2O_2诱导损伤后的细胞凋亡率变化。原代心肌细胞经72h培养并用转染的方法上调或下调miRNA-214的表达分为正常细胞组，及不同转染组（miRNA-214前体组、miRNA-214前体空白组、miRNA-214抑制剂组、miRNA-214抑制剂空白组）后各组都用H_2O_2（100μmol/L）诱导6h后用AnnexinV/PI染色细胞上流式细胞仪检测不同转染组的心肌细胞经H_2O_2诱导后的凋亡率。 5Western blot检测不同干预组PTEN的蛋白表达变化培养细胞分为正常对照组和H_2O_2（100μmol/L）干预组以及不同转染组（miRNA-214前体组、miRNA-214前体空白组、miRNA-214抑制剂组），分别提取各组蛋白进行蛋白定量检测。 结果： 1H_2O_2对心肌细胞有损伤作用MTT检测结果提示，随着H_2O_2浓度的升高，作用时间的延长，细胞活力（OD值）逐渐降低，呈明显的剂量和时间依赖性。AnnexinV/PI方法检测随着H_2O_2浓度的升高，细胞凋亡率逐渐增加，呈明显的剂量依赖性，说明H_2O_2可诱导心肌细胞损伤。我们选择引起细胞凋亡30%左右的H_2O_2浓度（100μmol/L）作用6h，建立氧化应激损伤模型。 2氧化应激损伤后的心肌细胞中miRNA-214的表达有变化RT-PCR检测到心肌细胞中miRNA-214的相对表达变化具有H_2O_2浓度依赖性。H_2O_2干预各组之间都有统计学差异（P0.05)。 3miRNA-214对H_2O_2诱导的心肌细胞凋亡有保护作用。流式结果表明H_2O_2100μmol/L诱导心肌细胞损伤6h后的miRNA-214前体组细胞凋亡率较正常细胞及miRNA-214抑制剂组都低，抑制剂组细胞凋亡率明显高于正常组和前体组均有统计学意义（P0.05)，而前体空白对照组、抑制剂空白对照组与未转染组相比凋亡率变化不大无统计学差异(P0.05）。说明miRNA-214对H_2O_2诱导损伤的心肌细胞有保护作用。 4PTEN是miRNA-214保护心肌细胞凋亡的作用靶基因。抑制了PTEN蛋白活性后，发现上调与下调miRNA-214表达变化对氧化应激损伤的心肌细胞凋亡率影响无差别。Western blot检测到经pre-miRNA-214转染后的心肌细胞中PTEN的蛋白表达量下降，而经转染anti-miRNA-214的细胞中PTEN的蛋白表达量增加，均与对照组有统计学意义。 结论： 1H_2O_2诱导的心肌细胞氧化应激损伤中miRNA-214的表达有变化且具有H_2O_2浓度依赖性。正常细胞、H2O（230、50、100μmol/L）其miRNA-214的表达随浓度增加而上升。 2miRNA-214对H_2O_2诱导的心肌细胞凋亡有保护作用。miRNA-214表达上调可降低心肌细胞凋亡率，表达下调可增加心肌细胞凋亡。 3PTEN是miRNA-214在调节心肌细胞凋亡中的靶基因。PTEN的表达量受miRNA-214的调节，miRNA-214上调后PTEN表达下降，miRNA-214下调后PTEN的表达增加，抑制PTEN活性后miRNA-214对心肌细胞凋亡的保护作用变得不明显。
【关键词】：microRNA-214 心肌细胞 H_2O_2 细胞凋亡 PTEN 细胞损伤
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12
• 材料与方法12-26
• 结果26-30
• 附图30-38
• 附表38-41
• 讨论41-45
• 结论45
• 参考文献45-49
• 综述 微小 RNA 在心肌肥大中的作用及机制49-56
• 参考文献53-56
• 致谢56-57
• 个人简历57

【参考文献】

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1 关欣;李应东;马海彦;刘凯;;新生大鼠心肌细胞原代培养分离方法的改进[J];中西医结合心脑血管病杂志;2009年01期

2 吴扬;耿鹏;王玉琴;刘艳;;MicroRNA-1在心肌肥大中对L-型钙通道β_2亚基的负性调控作用[J];中国应用生理学杂志;2012年04期

本文编号：568139