靶向gyrA基因反义肽肽核酸体外抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长的研究

发布时间：2017-07-25 18:18

  本文关键词：靶向gyrA基因反义肽肽核酸体外抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长的研究

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【摘要】：第一部分多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因高效反义寡核苷酸序列的筛选 目的:筛选出能与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA紧密结合的反义寡核苷酸序列。方法:利用Mfold、RNA Structure4.6两种计算机软件对多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA进行二级结构分析计算，根据最低自由能原则在其mRNA局部杂交松弛区设计一系列反义寡核苷酸，与体外转录的地高辛标记的gyrA mRNA进行斑点杂交，根据杂交信号的强弱验证其有效性，筛选与gyrA mRNA紧密结合的反义寡核苷酸序列。结果:寡核苷酸探针与gyrA mRNA斑点杂交结果显示计算机软件设计的10条反义寡核苷酸探针中，有5条显示出杂交信号，其中1条杂交信号最强，能够与gyrA mRNA稳定结合。结论:计算机辅助设计可作为初步筛选靶基因反义序列的方法，斑点杂交可模拟体内环境对设计的寡核苷酸与靶基因结合的有效性进行体外验证，，两者联合应用操作简便快捷，经济有效，可作为一种在体外高通量筛选高效反义序列的方法。 第二部分靶向gyrA基因反义肽肽核酸体外抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长 目的:研究以gyrA基因为靶点的反义肽核酸(peptide nucleicacid,PNA)对多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因表达的抑制作用和体外抗菌活性,探讨其作为新型抗感染制剂的潜在应用价值。方法:根据第一部分筛选出的能与多重耐药鲍曼不动杆菌CY-623生长必需基因gyrA mRNA紧密结合的反义寡核苷酸序列，合成肽核酸（PNA）PNA1,同时在gyrA基因转录起始区设计一条反义寡核苷酸序列,覆盖SD序列与起始密码子AUG,合成肽核酸PNA2。两条PNA分别与穿膜肽（cellpenetrating peptide，CCPs）序列（KFF）3K连接形成peptide-PNA (PPNA)。分别用不同浓度的PPNA1、PPNA2和碱基错配的PPNA3以及为连接（KFF）3K的PNA1处理CY-623菌株，37℃培养不同时间后测定细菌OD600值并做平板菌落计数观察其对细菌生长的抑制作用。采用逆转录（RT）-PCR检测gyrA基因mRNA表达水平观察其对靶基因表达的作用。结果: PPNA1、PPNA2均具有明显的靶基因抑制作用和体外抗菌活性，并且具有时间和浓度依赖性，两者的最低抑菌浓度分别为5μmol/L和10μmol/L，PPNA1与PPNA2联合使用时最低抑菌浓度为10μmol/L,其中PPNA1、PPNA2各5μmol/L。而PPNA3与PNA1对细菌生长无抑制作用。结论:以gyrA基因为靶的PNA可在体外高效抑制gyrA mRNA的表达并抑制细菌生长，其反义抑制作用具有较强特异性，穿膜肽（KFF）3K可显著增强PNA的抑制作用，反义抑制策略有望成为对抗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的新方法。
【关键词】：多重耐药鲍曼不动杆菌 gyrA 反义寡核苷酸 斑点杂交 肽核酸 gyrA 多重耐药鲍曼不动杆菌
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.99
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-15
• 第一部分 多重耐药鲍曼不动杆菌 gyrA 基因高效反义寡核苷酸序列的筛选15-29
• 前言15
• 1 材料和仪器设备15-17
• 2 实验方法17-22
• 3 实验结果22-27
• 4 讨论27-29
• 第二部分 靶向 gyrA 基因反义肽肽核酸体外抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长29-39
• 前言29
• 1 材料和仪器设备29-30
• 2 实验方法30-33
• 3 实验结果33-36
• 4 讨论36-39
• 参考文献39-42
• 全文小结42-43
• 文献综述43-55
• 参考文献48-55
• 致谢55-56
• 攻读学位期间发表的论文56-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王晓博,王升启;最佳反义药物的选择[J];国外医学.药学分册;2001年03期

2 孟娟;古勤生;林石明;彭斌;刘丽锋;田延平;李莉;;地高辛标记探针检测5种葫芦科作物病毒的斑点杂交方法[J];中国农业科学;2007年12期

本文编号：572627