利用合成的基因回路实现细胞水平上尿酸稳态控制的实验研究

发布时间：2017-08-01 04:26

  本文关键词：利用合成的基因回路实现细胞水平上尿酸稳态控制的实验研究

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【摘要】：合成生物学是后基因组时代新兴的一门综合性交叉学科，也是现代生命科学研究的热点领域之一。合成生物学主要是以传统生物学为基础，结合工程学、材料学、计算科学等其他学科技术，人工合成新的生物网络或系统，从而按照设计人员预想，表现出新的功能。近二十年来，合成生物学研究取得了长足的发展，其研究涉及生物医药、能源、材料、生物计算、军事应用等众多领域，为解决人类发展所面临的若干重大问题带来新的希望。 尿酸是嘌呤代谢的终产物，微溶于水，易形成尿酸盐晶体沉淀，是人体内主要的代谢产物之一，人体液中尿酸含量的变化可以反映出人体内代谢及免疫等身体机能的状况。人体内尿酸含量高于正常生理范围时称为高尿酸血症，长期的高尿酸血症易导致痛风、肿瘤溶解综合征等疾病。痛风是尿酸盐晶体在关节滑膜、软骨等组织沉积，引发的异物炎症反应。目前，针对痛风主要使用药物进行治疗，包括传统的别嘌醇等药物及新型的生物尿酸酶制剂等。传统药物安全性较好，但治疗效果不明显，且易引发严重的副反应；新型的生物尿酸酶制剂虽然具有快速、强大的降尿酸作用，但易诱发急性痛风发作，易引起超敏反应和耐药。合成生物学技术的发展，使研究人员看到了从基因、细胞水平上实现尿酸等代谢产物调控的曙光。有文献报导，耐辐射型球菌基因组中基因片段hucR，可翻译成具有转录抑制作用的蛋白HucR，在尿酸的介导下，HucR通过与基因hucO的相互结合或分离，进一步影响hucO下游基因的表达。 本研究的目的主要是以转录抑制物基因hucR及其结合位点基因hucO为基础，人工合成优化的转录抑制物基因mUTs及其结合位点的8串联结构基因hucO8，将mUTs和hucO8作为标准生物模块，构建具有尿酸感应及调控作用的基因回路，在细胞水平上研究回路对尿酸浓度的调控作用。主要研究内容及结果简要概述为以下几方面： 1、从NCBI数据库获取优化的转录抑制物基因mUTs及其结合位点的8串联结构基因hucO8的序列，优化的黄曲霉菌尿酸酶基因smUox的序列，进行化学合成，将含有目的基因mUTs、hucO8和smUox的载体分别命名为pMD18T-mUTs、pMD18T-hucO8和pGH-smUox。 2、以载体pcDNA3.1/V5-his（C）和pMD18T-mUTs为基础，构建优化的转录抑制物表达载体pcDNA3.1/V5-mUTs；以分泌型碱性磷酸酶（secreted alkalinephosphatase，SEAP）表达载体pSEAP2-control和载体pMD18T-hucO8为基础，构建含有8串联结构基因hucO8的报告基因表达载体pSEAP-hucO8；共转染pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8组成的双载体回路至HeLa细胞，通过检测转染48h后SEAP的表达量，验证了双载体回路的基本原理，证明了回路对尿酸具有一定的感应作用。 3、以双向共表达载体pBudCE4.1为基础，将基因片段mUTs和hucO8-SEAP整合至pBudCE4.1的两个多克隆位点区域，构建了双向共表达的单载体基因回路pBudCE4.1-SEAP-mUTs，转染至HeLa细胞，通过检测转染48h后SEAP的表达量，验证了单载体回路的基本原理，证明了单载体回路对尿酸具有一定的感应作用。6 4、以不同摩尔比的pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8或pcDNA3.1/V5-mUTs和pBudCE4.1-SEAP-mUTs共转染HeLa细胞，通过分析SEAP表达量的差异，研究mUTs和hucO8的比例对回路的影响，结果表明，一定范围内（本研究所用比例范围1:1-4:1），随着mUTs/hucO8的比例增加，mUTs对hucO8下游基因表达抑制作用逐渐增强，当mUTs/hucO8=4:1时，mUTs对hucO8下游基因表达抑制作用最强。 5、以载体pSEAP-hucO8和pGH-smUox为基础，构建了优化的黄曲霉菌尿酸酶表达载体phucO8-smUox；再以载体phucO8-smUox和pBudCE4.1为基础，构建了优化的黄曲霉菌尿酸酶表达载体pBudCE4.1-smUox，转染至HeLa细胞，通过检测转染48h后培养基中尿酸酶的含量，验证了smUox能在HeLa细胞中正确表达；最后以载体pBud4.1-smUox和pBudCE4.1-SEAP-mUTs为基础，成功构建了单载体尿酸调控回路pBudCE4.1-mUTs-smUox。 6、单独转染单载体尿酸调控回路（pBudCE4.1-mUTs-smUox）或者共转染双载体尿酸调控回路（phucO8-smUox、pcDNA3.1/V5-mUTs），通过检测转染48h后培养基中尿酸含量，对比转染前后尿酸含量差异。证明了单载体回路和双载体回路均具有一定的尿酸调控能力。本研究首先构建了双载体尿酸感应回路，通过检测转染后报告基因SEAP的表达量，验证了mUTs与hucO8的基本原理及回路对尿酸的感应作用，在此基础上，通过引入smUox，分别构建了双载体和单载体尿酸调控回路。相比于单载体回路，双载体回路的主要优点是可以自由控制转染时mUTs和hucO8的比例，但其同样具有以下几方面弊端：1.转染效率不确定，双载体回路在转染时无法准确控制转入HeLa细胞的mUTs和hucO8的比例；2.共转染实验操作相对复杂，实验成本相对较大；3.双载体回路在筛选稳定转染细胞系时，需要通过两个不同的筛选标记进行筛选，筛选难度相对较大，且筛选过程复杂。与之相比，单载体回路具有以下几方面优点：1.单独转染pBudCE4.1-mUTs-smUox代替了共转染pSEAP-hucO8和pcDNA3.1/V5-mUTs，简化了实验操作，节省了实验成本；2.单载体回路可以有效保证转入HeLa细胞的mUTs与hucO8的摩尔比，规避了转染效率不定等因素导致的mUTs与hucO8比例不确定问题；3.单独转染只需一个筛选标记，很大程度上方便了后续研究中稳定转染HeLa细胞系的筛选。 综上所述，本研究以mUTs和hucO8为标准生物模块，利用合成生物学的技术方法，成功构建了双载体及单载体尿酸调控回路，，验证了回路的作用原理，证明了回路对尿酸具有感应及调控作用，实现了在细胞水平上对尿酸进行调控的目的。且研究发现，在一定范围内，生物模块mUTs与hucO8的摩尔比，会通过影响hucO8下游基因的表达，进而影响回路对尿酸的调控作用。前述研究为进一步实现细胞水平上尿酸的稳态控制奠定了基础。
【关键词】：合成生物学 基因回路 尿酸 稳态控制
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 目录3-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 英文缩略词表14-15
• 第1章 前言15-22
• 1.1 合成生物学发展概述15
• 1.2 合成生物学的国内外发展现状15-17
• 1.2.1 国外合成生物学研究进展15-16
• 1.2.2 国内合成生物学研究进展16-17
• 1.3 合成生物学在生物医药领域的应用17-18
• 1.4 尿酸及高尿酸血症18
• 1.4.1 尿酸18
• 1.4.2 高尿酸血症及其治疗18
• 1.5 选题依据与研究目的18-19
• 1.5.1 选题依据18-19
• 1.5.2 研究目的19
• 1.6 主要研究内容19-20
• 1.6.1 基础载体的构建19-20
• 1.6.2 双载体基因回路的功能验证20
• 1.6.3 单载体基因回路的构建与功能验证20
• 1.6.4 基于 smUox 的基因回路构建与功能验证20
• 1.7 技术路线20-21
• 1.8 研究意义21-22
• 第2章 基础载体的构建22-31
• 2.1 实验材料22-23
• 2.1.1 菌种和质粒22
• 2.1.2 主要试剂和试剂盒22
• 2.1.3 培养基及其他溶液22-23
• 2.1.4 实验仪器23
• 2.2 实验方法23-27
• 2.2.1 化学合成基因片段 mUTs 和 hucO_823-24
• 2.2.2 质粒 DNA 化学转化至大肠杆菌 DH5 感受态24
• 2.2.3 单克隆挑取及菌液培养24
• 2.2.4 菌液保存及复苏24
• 2.2.5 大肠杆菌质粒 DNA 提取24-25
• 2.2.6 质粒 DNA 双酶切鉴定25-26
• 2.2.7 质粒 DNA 双酶切回收26
• 2.2.8 DNA 琼脂糖凝胶电泳26
• 2.2.9 DNA 凝胶片段回收26-27
• 2.2.10 目的片段连接27
• 2.3 实验结果27-29
• 2.3.1 pMD18T-mUTs 和 pMD18T-hucO8酶切验证结果27-28
• 2.3.2 pSEAP-hucO8的构建28-29
• 2.3.3 pcDNA3.1/V5-mUTs 的构建29
• 2.4 小结29-31
• 第3章 双载体基因回路的功能验证31-43
• 3.1 实验材料31-32
• 3.1.1 细胞株和质粒31
• 3.1.2 主要试剂和试剂盒31
• 3.1.3 培养基及其他溶液31-32
• 3.1.4 实验仪器32
• 3.2 实验方法32-35
• 3.2.1 HeLa 细胞复苏32
• 3.2.2 HeLa 细胞传代培养32-33
• 3.2.3 HeLa 细胞冻存33
• 3.2.4 细胞计数及接种 24 孔细胞培养板33
• 3.2.5 转染用质粒提取33-34
• 3.2.6 Lipofectamine 2000 转染 HeLa 细胞34
• 3.2.7 SEAP 化学发光检测34-35
• 3.2.8 MTT 实验35
• 3.3 实验结果35-41
• 3.3.1 转染条件及检测时间摸索35-38
• 3.3.2 回路基本原理验证38-39
• 3.3.3 回路对尿酸感应作用分析39-41
• 3.4 讨论41-42
• 3.5 小结42-43
• 第4章 单载体基因回路的构建与功能验证43-57
• 4.1 实验材料43-45
• 4.1.1 菌种质粒及细胞株43
• 4.1.2 主要试剂和试剂盒43
• 4.1.3 培养基及其他溶液43-44
• 4.1.4 实验仪器44-45
• 4.2 实验方法45-48
• 4.2.1 质粒 DNA 转化大肠杆菌 DH5 感受态45
• 4.2.2 单克隆挑取、菌夜培养及质粒 DNA 提取45
• 4.2.3 PCR 基因改造45-46
• 4.2.4 PCR 产物回收及连接 T 载体46
• 4.2.5 DNA 双酶切鉴定46-47
• 4.2.6 DNA 双酶切回收47-48
• 4.2.7 目的片段连接48
• 4.2.8 细胞计数、铺板及转染48
• 4.2.9 SEAP 化学发光检测48
• 4.3 实验结果48-55
• 4.3.1 PCR 改造 mUTs 基因48-49
• 4.3.2 pBudCE4.1-SEAP 的构建49-50
• 4.3.3 pBudCE4.1-SEAP 功能验证50-51
• 4.3.4 pBudCE4.1-SEAP-mUTs 的构建51-52
• 4.3.5 单载体回路基本功能验证52-54
• 4.3.6 回路对尿酸感应作用分析54-55
• 4.4 讨论55-56
• 4.5 小结56-57
• 第5章 基于 smUox 的基因回路构建与功能验证57-73
• 5.1 实验材料57-59
• 5.1.1 菌种和质粒57
• 5.1.2 主要试剂和试剂盒57
• 5.1.3 培养基及其他溶液57-58
• 5.1.4 实验仪器58-59
• 5.2 实验方法59-63
• 5.2.1 基因 smUox 的化学合成59
• 5.2.2 质粒提取59-60
• 5.2.3 DNA 双酶切鉴定60
• 5.2.4 DNA 双酶切回收60-61
• 5.2.5 目的片段连接61
• 5.2.6 细胞计数、铺板及转染61-62
• 5.2.7 尿酸检测62
• 5.2.8 尿酸酶检测62-63
• 5.3 实验结果63-71
• 5.3.1 尿酸和尿酸酶标准曲线63-64
• 5.3.2 phucO8-smUox 的构建64-65
• 5.3.3 pBudCE4.1-smUox 的构建65-66
• 5.3.4 pBudCE4.1-smUox 功能验证66-67
• 5.3.5 pBudCE4.1-mUTs-smUox 的构建67
• 5.3.6 回路对尿酸调控作用分析67-71
• 5.4 讨论71
• 5.5 小结71-73
• 总结与展望73-75
• 总结73
• 展望73-75
• 参考文献75-79
• 附录79-81
• 文献综述81-87
• 1 合成生物学概述81
• 2 合成生物学的国内外发展现状81-83
• 3 合成生物学在生物医药领域的应用83
• 4 展望83-84
• 参考文献84-87
• 攻读硕士期间发表文章、申请专利、参与会议87-88
• 作者简介88-89
• 致谢89-90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 辛雅雯;曾正英;陈国良;;痛风治疗药物及其研究进展[J];中国药物化学杂志;2012年05期

本文编号：602508