人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与初步应用

发布时间：2017-08-02 04:13

  本文关键词：人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与初步应用

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【摘要】：人冠状病毒NL63是有包膜的单股正链RNA病毒，系统分类学上属于冠状病毒ɑ组。棘突蛋白是病毒表面长的花瓣样结构，在电子显微镜下形似王冠，是以三聚体形式存在的膜锚定的糖蛋白。S蛋白在病毒与细胞受体吸附、膜融合过程中发挥重要作用，同时介导不依赖补体的中和抗体的产生。经研究，棘突蛋白是决定病毒组织嗜性和病毒毒力的主要因素。同其他冠状病毒一样，HCoV-NL63S蛋白可分为两个亚结构域，分别是位于N端的包含受体结合区（Receptor bindingdomain,RBD）的S1区（21～717aa）；和位于C端的包含跨膜区（Transmembranedomain,TMD）的S2区（718～1356aa）。其中，S1区介导病毒与受体的识别和结合，，S2区则与细胞融合有关。对HCoV-NL63RBD的分析表明最基本的受体结合区域位于S1区中476～618aa（RS），但较大的受体结合区片段（RL，232～684aa）与人血管紧张素转换酶（Human angiotensin-converting enzyme,hACE）2的结合能力明显优于RS。 本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区（RBD）大、小蛋白的表达纯化，进行免疫学鉴定，将重组蛋白用于测定HCoV-NL63基因工程疫苗免疫小鼠后血清中的抗体滴度并将其用于检测人群血清中的特异性抗体。 上述研究结果为深入研究HCoV-NL63感染流行规律、RBD的生物学功能及疫苗研发提供了基础。 首先，利用本室前期密码子优化合成的HCoV-NL63S基因序列，设计受体结合区RBD(RL)（232～684aa）、RBD(RS)(476～616aa)蛋白编码基因的特异性引物，并在5＇端与3＇端分别引入NcoI、XhoI酶切位点。利用PCR对片段进行扩增，酶切扩增片段以及表达载体pM48，连接转化。挑取单克隆进行酶切鉴定并测序，成功获得表达质粒pM48-RS与pM48-RL。 将上述重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS，经过优化表达条件，确定最佳诱导表达条件为37℃，0.8mM IPTG诱导4h时，蛋白表达量达到最高，融合蛋白主要以包涵体形式表达。 将上述重组蛋白超声后收集的沉淀溶解在6M盐酸胍中，进行亲和层析后获得纯化的RS与RL融合蛋白，经分析，蛋白纯度大于95%。Western blot显示，两个融合蛋白均与痘苗病毒（天坛株）表达的相应蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应。 将纯化的重组蛋白RS与RL应用于HCoV-NL63基因工程疫苗免疫小鼠后血清中的抗体滴度的测定，检测结果显示，质粒免疫和痘苗病毒联合免疫后小鼠血清中的抗体水平比单独质粒免疫后小鼠血清中的抗体水平高。 将融合蛋白作为检测抗原，我们建立了WBLA(Western Blotting Line Assay)检测方法，并用该方法检测了30份正常成人血清中人冠状病毒NL63特异性抗体，30份血清中，用RL检出18份阳性血清，检出率为60%；RS检出18份阳性血清，检出率为60%；IFA检出18份阳性血清，检出率为60%。基于RL与RS的WBLA检测符合率为79.15%；基于RL的WBLA及基于RS的WBLA与IFA的符合率为58.33%。并应用重组蛋白作为包被抗原为间接ELISA检测方法的建立做了初步探索。
【关键词】：HCoV-NL63 RBD 大肠杆菌 蛋白表达纯化 疫苗 血清学检测
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373;Q78
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-13
• 技术路线13-14
• 材料与方法14-32
• 实验结果32-50
• 第一部分 人冠状病毒 NL63 受体结合区蛋白的表达纯化与鉴定32-41
• 1 HCoV-NL63 RS 与 RL 蛋白基因的合成及表达载体构建与鉴定32-34
• 1.1 HCoV-NL63 RBD(L) 蛋白基因的合成及密码子优化32
• 1.2 HCoV-NL63 RBD(L) 、RBD(S)蛋白基因的克隆32-33
• 1.3 重组表达质粒 pM48-RS 和 pM48-RL 的构建33-34
• 1.4 重组表达质粒 pM48-RS 和 pM48-RL 的鉴定34
• 2 HCoV-NL63 RS 与 RL 融合蛋白表达条件优化与确定34-37
• 2.1 表达菌株的筛选34-36
• 2.2 RS 与 RL 蛋白表达形式及最佳诱导表达条件的确定36-37
• 3 HCoV-NL63 RS 与 RL 融合蛋白的纯化研究37-39
• 3.1 重组融合蛋白 RS 的纯化37-38
• 3.2 重组融合蛋白 RL 的纯化38-39
• 3.3 重组融合蛋白产率的初步计算39
• 4 HCoV-NL63 RS 与 RL 融合蛋白的 WB 鉴定39-41
• 第二部分 重组 RBD 蛋白用于 HCoV-NL63 基因工程疫苗免疫小鼠后抗体的检测41-43
• 1 抗原最佳包被浓度的确定41
• 2 交叉反应的确定41-42
• 3 测定小鼠血清中特异性抗体滴度42-43
• 第三部分 重组 RBD 蛋白用于 HCoV-NL63 感染人群抗体检测43-50
• 1 WBLA(Western Blotting Line Assay)方法的建立及与 IFA 方法检测结果的比较43-48
• 1.1 WBLA 方法的建立43-44
• 1.2 基于 RL 或 RS 蛋白的 WBLA 灵敏度检测44
• 1.3 WBLA 检测人群中特异性抗体44-48
• 2 ELISA 方法的初步探索48-50
• 讨论50-53
• 全文小结53-54
• 参考文献54-57
• 综述57-65
• 参考文献61-65
• 作者简介65-66
• 致谢66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 赵国霞;周为民;陆柔剑;王惠娟;赵敏;张庭瑛;邓瑶;高基民;谭文杰;;表达人冠状病毒NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒的制备与表达分析[J];病毒学报;2011年03期

2 周为民;张陵林;陆柔剑;王慧娟;谭文杰;阮力;;人冠状病毒NL63核壳蛋白和棘突蛋白的表达及其在血清学检测中的初步应用[J];生物技术通讯;2010年02期

3 赵国霞;高基民;谭文杰;;人冠状病毒NL63棘突蛋白的研究进展[J];生物技术通讯;2010年06期

本文编号：607568