梅毒螺旋体黏附素Tp0751抗原表位的预测与鉴定

发布时间：2017-08-03 04:05

  本文关键词：梅毒螺旋体黏附素Tp0751抗原表位的预测与鉴定

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【摘要】：目的：筛选和鉴定梅毒螺旋体(Treponema pallidum, Tp)粘附素Tp0751潜在的B表位、Th表位或联合Th-B表位，为Tp多价表位疫苗的深入研究提供实验依据和基础。 方法： （1） Tp0751蛋白抗原表位预测：从Genbank查获Tp0751蛋白的氨基酸序列，运用SYFPEITHI、HLAPrep、IEDB等软件分析该蛋白的HLA-II类限制性Th细胞表位；利用EMBOSS和IEDB等在线软件分析该段氨基酸亲水性、β-转角、抗原性、表面可及性等特性，综合分析预测Tp0751蛋白的B表位；以上结果重叠部分预测为联合B-Th细胞表位。 （2） Tp0751蛋白抗原表位多肽人工合成与鉴定：反相高效液相色谱(RP—HPLC)人工合成和纯化预测的表位多肽，质谱分析鉴定合成的多肽。 （3） Tp0751蛋白原核表达与抗原性鉴定：构建pET28a(+)/Tp0751的原核表达重组载体(不含信号肽氨基酸编码序列)，经双酶切、PCR和测序鉴定后转化至E.coli BL21(DE3)表达菌诱导表达；Western blot和SDS-PAGE分别鉴定经Ni-NTA纯化的目的蛋白的抗原性和表达形式；以Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，BCA法测定蛋白浓度。 （4）兔血清与脾细胞制备及重组蛋白免疫性测定：将重组Tp0751经皮下注射新西兰兔共5次，分别收集血清，以重组蛋白检测抗体效价，鉴定其免疫原性，并用于Tp0751的B细胞表位鉴定；末次免疫后第10天，采集兔脾细胞，，用于Tp0751的Th细胞表位鉴定。 （5） Tp0751的B细胞表位鉴定：分别以预测为B/B-Th表位的合成多肽和重组表达蛋白为包被抗原包被微孔板，梅毒阳性病人血清和免疫兔血清为一抗，同时设立阴性对照组，间接ELISA法检测鉴定预测的Tp0751B细胞表位或联合B-Th细胞表位。 （6） Tp0751的Th细胞表位鉴定：以预测为T/Th-B表位的合成短肽刺激培养兔脾细胞，同时设立ConA和重组Tp0751全蛋白刺激组为阳性对照，PBS刺激组为阴性对照，CCK-8法检测刺激兔脾细胞的增殖水平，Realtime-PCR测定IL-4和INF-γ mRNA水平，鉴定Th细胞表位。 结果： （1） Tp0751蛋白抗原表位预测：分析总结在线软件预测出P1(65-83AA)、P2(90-101AA)、P3(127-137AA)、P4(221-237AA)、P5(175-185AA)为Tp0751候选B细胞表位；P5(175-185AA)、P6(103-113AA)、P7(162-171AA)为候选Th细胞表位；P5(175-185AA)为候选联合Th-B表位。 （2）人工合成多肽：质谱检测合成多肽相对分子质量，测定值与理论值相符；RP-HPLC法测定各合成多肽的纯度均达90%以上，满足实验要求。 （3） Tp0751蛋白表达及其抗原性与免疫原性鉴定：酶切及测序鉴定证实重组质粒pET28a(+)/Tp0751插入片段序列与GenBank登录序列完全一致；可溶性表达约26kDa大小重组蛋白，纯化后纯度达95%以上；Western blot显示，重组蛋白仅与梅毒阳性病人血清产生特异性反应；ELISA检测免疫兔血清抗Tp0751效价均在1:12000以上。 （4） Tp0751的B细胞表位鉴定：ELISA结果显示，预测表位P4、P5与梅毒患者血清、免疫兔血清均呈阳性反应，而与健康人血清不反应。 （5） Tp0751的Th细胞表位鉴定：CCK-8法检测预测多肽刺激的兔脾细胞无明显增殖，Realtime-PCR显示刺激脾细胞的IL-4和INF-γ mRNA水平无明显增高。 结论 （1）高效表达可溶性重组Tp0751蛋白，该蛋白具有良好的免疫原性与抗原性； （2）预测的表位P4、P5可能为Tp0751蛋白B细胞表位； （3）预测的表位P5、P6、P7非兔MHC提呈Tp0751蛋白Th细胞表位。
【关键词】：梅毒螺旋体 Tp0751 B细胞表位 Th细胞表位 粘附素
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R377.1
【目录】：

• 主要中英文缩写4-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-13
• 实验材料13-16
• 实验方法16-30
• 实验结果30-39
• 讨论39-42
• 结论42-43
• 参考文献43-47
• 附录47-51
• 综述51-61
• 参考文献58-61
• 在读期间科研成果61-62
• 致谢62

【参考文献】

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1 李胜涛;刘昌文;邹泽红;陶爱林;;MHC-Ⅱ类抗原表位预测软件的对比评价[J];生物医学工程研究;2010年02期

本文编号：612532