酵母双杂交技术筛选Cpn0147和Cpn0308配体的研究

发布时间：2017-08-03 14:31

  本文关键词：酵母双杂交技术筛选Cpn0147和Cpn0308配体的研究

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【摘要】：肺炎衣原体(Chlamydiapneumonia, Cpn)是一类严格的细胞内生长并具有独特的二相发育周期的病原微生物,主要引起呼吸道和肺部感染,并与心脑血管疾病的发生、发展密切相关。现有研究显示部分衣原体基因编码的分泌性蛋白以及包涵体膜蛋白(inclusion protein, Inc)在衣原体的一系列生命活动过程中扮演重要角色,其中Cpn0147与Cpn0308为已发现的衣原体包涵体膜蛋白,但其对衣原体生长发育的影响及与宿主细胞的相互作用机制尚不清楚。为此本研究构建了HeLa细胞的酵母GAL4AD融合的cDNA文库,应用酵母双杂交技术寻找Cpn0147, Cpn0308的配体蛋白,为进一步探讨Cpn0147, Cpn0308的特性和可能的生物学作用提供了前瞻性研究。 首先,采用Trizol法从HeLa提取总的RNA,应用SMARTTM技术,以CDSⅢ、SMARTⅢ为引物,同时加入MMLV反转录酶合成cDNA第一链,在经LD-PCR合成双链cDNA后用CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化双链cDNA,去除200bp以下的片段；将制备好的ds cDNA与pGAD T7-Rec、Herring Tests Carrier DNA(已变性)转化到酵母Y187感受态细胞中进行同源重组,在SD/-Leu/Amp+平板上培养4d后,用冷冻培养基收集菌体,做菌落PCR检测文库多态性；经琼脂糖凝胶电泳结果显示,PCR产物大小在0.3～3kb之间,显示文库具有良好的多态性。 然后从Cpn菌株AR39基因组中PCR扩增特异性片段Cpn0147, Cpn0308,经限制性内切酶EcoRⅠ和BamH Ⅰ双酶切后克隆到诱饵载体pGBKT7中；经菌落PCR、EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切初步验证后,以pGBKT7载体上的T7引物作为测序引物进行碱基序列测定,测序结果经BLAST分析证实为Cpn0147, Cpn0308,将构建成功的诱饵质粒同时转化酵母菌株AH109和Y187,经检测无自激活和细胞毒性作用。 最后分别将诱饵基因pGBKT7-Cpn0147, pGBKT7-Cpn0308与HeLa细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库进行酵母双杂交；用p-半乳糖苷酶印膜法、质粒PCR进行筛选,并通过回交实验进行验证；对阳性质粒进行碱基序列测定,经BLASK比对检测其同源蛋白,确定筛选基因。结果显示,Cpn0147、Cpn0308与HeLa细胞cDNA文库中多个基因的编码产物发生了相互作用,其中CpnO147杂交结果包括脂肪酰辅酶A结合蛋白(ACBD3)、环腺苷酸应答原件结合蛋白3(CREB3)、低密度脂受体相关蛋白11(LRP11)、离子通道相关蛋白(FXYD5)、真核翻译延长因子1D(EEF1D)。Cpn0308杂交结果为脂肪酰辅酶A结合蛋白(ACBD3)。利用酵母双杂交的方法初步成功筛选出与Cpn0147, Cpn0308相互作用的配体基因,为进一步研究其生物学功能打下了基础。
【关键词】：cDNA文库 HeLa细胞 包涵体膜蛋白 诱饵载体 酵母双杂交
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 英文~.写9-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-28
• 结果28-32
• 附图32-39
• 附表39-40
• 讨论40-44
• 结论44-45
• 参考文献45-51
• 综述51-60
• 参考文献56-60
• 致谢60-61
• 个人简历61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：614864