利用TALEN技术高效敲除金黄地鼠Rag1基因及金黄地鼠γ-干扰素单克隆抗体的初步制备

发布时间：2017-08-03 14:21

  本文关键词：利用TALEN技术高效敲除金黄地鼠Rag1基因及金黄地鼠γ-干扰素单克隆抗体的初步制备

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【摘要】：金黄地鼠(Golden hamster; Mesocricetus auratus)又称叙利亚地鼠。金黄地鼠已经作为感染和疾病模型用于许多研究,它经常被用于模拟人疾病在自然条件下的发生过程。金黄地鼠相对于其他啮齿类动物相比自然状态下肿瘤发病比率相对较低,有研究称只有0.5%-17%,因此说金黄地鼠是一个很好的肿瘤模型。重要的是金黄地鼠已经被公认为是一个宝贵的模式动物用于研究由病毒引起的人类疾病。例如布亚病毒(bunyaviruses),沙粒病毒(arenaviruses),虫媒病毒(flaviviruses),汉尼拔病毒(henipaviruses)和SARS冠状病毒。用金黄地鼠作为一个评价溶肿瘤腺病毒的疗效和毒性的肿瘤动物模型具有小鼠和大鼠无法比拟的先天优势。由于小鼠正常组织不支持人腺病毒复制,因此,小鼠模型无法很好的评价溶肿瘤腺病毒。而金黄地鼠被美国FDA认为是评价溶肿瘤腺病毒标准的动物模型,金黄地鼠正常组织如肺、肝脏都能支持腺病毒的复制。 金黄地鼠是近几年才被大家广泛接受的一种模式动物,基于金黄地鼠的转基因动物和抗体还十分的稀少。无法对利用金黄地鼠为动物模型的实验进行深入的探讨,限制了金黄地鼠的应用。因此我们围绕金黄地鼠动物模型的两个方面设计了实验。第一,利用新型基因修饰技术类转录激活因子效应因子敲除金黄地鼠Ragl基因制备免疫缺陷的转基因金黄地鼠。第二,运用传统的单克隆抗体技术制备金黄地鼠γ-干扰素的单克隆抗体,用于转基因金黄地鼠的相关实验检测。 类转录激活因子效应因子(transcription activator-like effectors, TALE)是一种最早在植物病原黄单胞菌中发现的,可以识别特异DNA序列的,天然的DNA结合蛋白。利用其这种特性,通过和相关功能性蛋白Fokl的融合表达,可以实现在体内和体外特异的结合和修饰基因组DNA的目的。Fok1是一个非特异的核酸内切酶,但是只有当它形成二聚体时才能行使内切酶的功能。最近几年,TALEN广泛应用于基因的敲入和敲除,转基因动物模型建立,基因治疗等方面。 经过实验,我们通过显微注射把TALEN转录的mRNA打进斑马鱼和大鼠的受精卵中,并对结果进行测序,在斑马鱼和大鼠体内验证了所设计的TALEN的敲除效率,得到了一对高效TALEN,通过将此TALEN转录的mRNA经显微注射进斑马鱼和大鼠受精卵后,在斑马鱼中验证其效率为17.9%。于此同时我们通过原核表达金黄地鼠Y-干扰素蛋白并用此蛋白免疫小鼠,经过细胞融合和克隆筛选,也已经成功得到5株抗金黄地鼠γ-干扰素的单克隆抗体,并用ELISA和Western Blot的方法进行了初步验证。该研究为拓展使用金黄地鼠模型用于医学科学研究提供了有力的工具。
【关键词】：金黄地鼠 类转录激活因子效应因子TALEN γ-干扰素 单克隆抗体
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：Q78;R392;R-332
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 第一部分：利用TALEN技术高效的敲除金黄地鼠Rag1基因9-20
• 1 引言9-11
• 2 实验所需主要仪器及公司11
• 3 实验所需试剂及配制11-13
• 4 实验材料和方法13-16
• 5 实验结果16-18
• 6 讨论18-20
• 第二部分：金黄地鼠γ-干扰素的单克隆抗体的制备20-44
• 1 引言20-22
• 2 实验所需主要仪器及公司22-23
• 3 试剂23-27
• 4 实验方法27-36
• 5 实验结果36-42
• 6 讨论42-44
• 参考文献44-46
• 综述 新型基因修饰技术ZFN和TALEN的应用46-60
• 参考文献56-60
• 致谢60

【共引文献】

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本文编号：614802