TLRs介导的GLUTs和MCTs表达变化对神经元存活的影响及其机制

发布时间：2017-08-03 14:11

  本文关键词：TLRs介导的GLUTs和MCTs表达变化对神经元存活的影响及其机制

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【摘要】：葡萄糖是神经元活动的主要燃料，神经活动引起能量需求增加主要通过葡萄糖的氧化代谢来满足。大多数哺乳动物细胞的葡萄糖转运是通过其细胞膜上的葡萄糖转运体（glucose transporters，GLUTs）家族实现的。在哺乳动物大脑利用葡萄糖的过程中，主要是GLUT1和GLUT3在发挥作用。大脑神经元主要表达GLUT3、GLUT6和GLUT8。胰岛素、神经生长因子或H2O2等可以通过PI3K-AKT、MAPKs、cAMP或NF-κB信号转导途径调节GLUT3的表达和葡萄糖的摄取。近年来的研究表明，神经活动期间神经元能够摄取胶质细胞释放的乳酸作为其主要能量代谢底物。糖酵解产生的乳酸通过细胞膜上的单羧酸转运体（monocarboxylate transporters，MCTs）转运出胶质细胞，使神经元很容易通过自身膜上的MCTs将乳酸摄入，以满足神经元活动期间增加的能量需求。中枢神经系统（central nervous system, CNS）表达MCT1、MCT2和MCT4，其中MCT2主要表达于神经元。研究发现，去甲肾上腺素可通过PI3K-Akt和mTOR/S6K途径增加MCT2的表达。曾有实验报道，当神经元处于富含葡萄糖和乳酸的环境中时，会优先使用乳酸作为主要的氧化底物。该结果表明即使是在血糖正常的情况下乳酸也可优先于葡萄糖作为脑代谢的燃料。 Toll样受体（Toll-like receptors, TLR）是一种重要的模式识别受体（patternrecognition receptor, PRRs），能够识别病原体相关分子模式（pathogen associatedmolecular pattern, PAMPs)，构成机体抵御病原体入侵的第一道防线。现有的文献表明，人和小鼠的CNS也表达TLRs，它们在一系列CNS感染和非感染疾病中起着十分重要的作用。最近几年越来越多的证据表明，神经元细胞表达TLR家族的多个成员，TLR3和TLR8首先分别被发现在人神经元细胞系和小鼠皮质神经元中表达，正常小鼠神经元表达TLR1-8和TLR10-13的mRNA和TLR2、TLR6的蛋白；病毒感染后神经元细胞的TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8蛋白被诱导表达，表明TLRs在神经元病毒感染中起着十分重要的作用。有报道表明激活TLR9能够使神经元细胞内的能量底物减少并使AMP/ATP比值增加，进而激活AMP激活的蛋白激酶（AMPK），从而使神经元的缺氧性应激耐受力增加，并且没有典型的炎症反应产生；在骨髓来源的脂肪细胞中，激活TLR3或TLR4能够导致GLUT4表达下降并降低胰岛素诱导的葡萄糖摄取和增加脂肪分解。另有报道表明，神经元能量缺失后能够导致其TLR2和TLR4的表达上调，进而导致神经元死亡，这些结果表明TLRs在参与细胞的能量代谢方面起着十分重要的作用。病毒感染神经元后，在其复制和转录过程中就合成了dsRNA和ssRNA，这些dsRNA和ssRNA能够作为病原相关分子模式而被神经元的TLR3、TLR7和TLR8等识别，从而启动免疫应答。本课题中我们用ply(I:C)（一种合成的dsRNA，模拟病毒dsRNA）和R848（一种合成的化合物，TLR7和TLR8的特异性配体）分别模拟dsRNA和ssRNA刺激体外培养的神经元细胞，初步研究了dsRNA与TLR3相互作用或ssRNA与TLR7/8相互作用是否会影响神经元GLUTs和MCTs的表达，从而影响神经元对葡萄糖和乳酸的利用，并且是否因此影响神经元的存活及其相关机制，以期探讨病毒感染神经元过程中其dsRNA和ssRNA通过TLRs介导造成的神经病理损伤机制，为神经系统病毒感染性疾病的防治研究提供新的理论依据。 第一部分TLRs激活对体外胎鼠皮质神经元存活的影响 目的：建立胎鼠皮质神经元体外培养体系，用poly(I:C)或R848处理胎鼠皮质神经元，观察TLR3或TLR7/8激活是否会影响胎鼠皮质神经元细胞的存活。 方法：选取孕16-18d的C57BL/6野生型孕鼠和TLR3-/-型孕鼠，脱颈处死后取出胎鼠大脑皮质部分，剪碎、消化、吹打后制成单细胞悬液，培养于预先经多聚赖氨酸处理过的培养板上，用Neurobasal培养基（含2%B27、1%胎牛血清和1%谷氨酰胺）体外培养8d成为成熟的神经元细胞，以MAP2作为神经元的特异性标记物，以DAPI标记所有细胞的细胞核，荧光显微镜下计数所有表达MAP2的细胞个数和所有细胞核的个数，计算出神经元细胞所占比率，具体计算公式为MAP2标记细胞个数/DAPI染色的细胞个数，以此检测体外培养的神经元纯度；用poly(I:C)刺激培养8天后的神经元，按照对照组、不同浓度poly(I:C)刺激分组，在作用不同时间后，通过MTT法检测野生型和TLR3-/-型胎鼠皮质神经元细胞活性；通过流式细胞术（FCM）检测野生型和TLR3-/-型神经元细胞的凋亡情况。用R848刺激野生型神经元，用MTT法检测其细胞活性，与对照组即仅DMSO处理组进行比较。 结果：体外培养的胎鼠皮质神经元细胞纯度达到90%以上，可以用于后续实验。poly(I:C)和R848分别刺激神经元后，都能够导致野生型胎鼠皮质神经元活性显著降低，，而poly(I:C)不能使TLR3-/-型胎鼠皮质神经元的活性显著降低。FCM结果也表明，poly(I:C)刺激神经元24h后，野生型胎鼠皮质神经元的早期凋亡和晚期凋亡比对照组增多，而TLR3-/-型胎鼠皮质神经元的刺激组和对照组无明显差异。 结论：poly(I:C)能够通过激活TLR3影响神经元细胞的存活，并且导致神经元细胞出现早期凋亡，而R848也能通过激活TLR7/8导致神经元细胞死亡。 第二部分TLRs介导的胎鼠皮质神经元GLUTs和MCTs表达变化 目的：研究poly(I:C)激活TLR3和R848激活TLR7/8是否会影响胎鼠皮质神经元细胞GLUTs和MCTs mRNA和蛋白的表达。 方法：以体外培养8d、纯度达到90%以上的神经元细胞作为研究对象，实验分为：对照组、20μg/ml终浓度的poly(I:C)处理不同时间（1h、4h、10h、15h）组、不同浓度的poly(I:C)（10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）刺激相同时间（10h）组、30μg/ml终浓度的R848处理不同时间（1h、4h、12h、15h）组、不同浓度的R848（5μg/ml、30μg/ml、60μg/ml）刺激相同时间（12h）组等，然后抽提RNA，逆转录后通过Real-timePCR法检测GLUTs和MCTs的mRNA表达变化；再按照对照组、20μg/ml终浓度的poly(I:C)处理不同时间（12h、24h、36h）组、不同浓度的poly(I:C)（10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）刺激相同时间（24h）组、30μg/ml终浓度的R848处理不同时间（12h、24h、36h）组、不同浓度的R848（5μg/ml、30μg/ml、60μg/ml）刺激相同时间（24h）组，收集细胞抽提蛋白质，通过Western blotting检测GLUTs和MCTs蛋白表达的变化。 结果：研究结果发现，poly(I:C)刺激神经元细胞不同时间，TLR3-/-型胎鼠皮质神经元GLUTs和MCTs的mRNA和蛋白表达无明显变化；野生型胎鼠神经元细胞的GLUT3、GLUT8和MCT2的mRNA在刺激10h后表达下降，20μg/ml poly(I:C)刺激神经元24h后GLUT3、GLUT8和MCT2的蛋白表达水平明显下降，且随着刺激时间的延长，GLUT3、GLUT8和MCT2的蛋白表达水平下降更为明显；而用R848刺激野生型胎鼠皮质神经元细胞后能够导致GLUT3和MCT2mRNA和蛋白表达水平上调，并且随着刺激浓度的增加而增加。 结论：poly(I:C)刺激神经元细胞后能够导致GLUT3、GLUT8和MCT2的mRNA和蛋白质表达下降，而R848刺激神经元细胞后能够上调神经元细胞GLUT3、MCT2的mRNA和蛋白表达。 第三部分TLRs介导的胎鼠皮质神经元GLUTs和MCTs表达变化的相关分子机制初探 目的：探讨poly（I:C）激活TLR3和R848激活TLR7/8影响神经元细胞表达GLUT3、GLUT8和MCT2的相关机制。 方法：体外培养8d纯度达到90%以上的神经元细胞作为研究对象，按照对照组、20μg/ml终浓度poly（I:C）刺激组、30μg/ml终浓度R848刺激组、20μg/ml终浓度poly（I:C）+PDTC/bx-795（或PDTC/bx-795）刺激组分组，Real-time PCR检测poly(I:C)或R848刺激后神经元细胞表达细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-6mRNA的变化；ELISA检测IFN-β、TNF-α、IL-6蛋白水平；Western Blot检测TLR3信号通路相关分子TBK1、IRF3、IRF7、NF-κB、p38、ERK、JNK等的磷酸化水平。Real-time PCR和Western Blot方法检测分别加入两种信号通路抑制剂预处理再用poly(I:C)刺激后，神经元细胞GLUT3、GLUT8和MCT2的mRNA和蛋白表达变化。 结果：poly(I:C)刺激胎鼠皮质神经元10h后，细胞的IFN-β、TNF-α、IL-6mRNA表达上调， IL-6和IFN-β蛋白表达增加，R848刺激胎鼠皮质神经元12h后，细胞的IFN-β、TNF-α、IL-6mRNA表达上调，但是只有IFN-β蛋白表达增加。Western Blot结果显示，经poly（I:C)刺激后，神经元细胞TBK1、IRF3、IRF7、p65的磷酸化水平上调，然而p38、ERK和JNK的磷酸化水平未发生变化。分别用NF-κB的抑制剂PDTC和TBK1的抑制剂bx-795处理细胞，然后用poly(I:C)刺激，结果发现用PDTC预处理后能够部分抑制poly(I:C)下调神经元细胞GLUT3、GLUT8和MCT2表达的作用，而用bx-795预处理对poly(I:C)下调神经元细胞GLUT3、GLUT8和MCT2表达的作用没有影响。 结论：TLR3可能通过NF-κB信号转导途径抑制神经元细胞表达GLUT3、GLUT8和MCT2，导致神经元细胞内能量代谢障碍，从而影响神经元细胞的存活，并且可能与激活TLR3或TLR7/8诱导产生的细胞因子有关。
【关键词】：神经元 葡萄糖转运体 单羧酸转运体 Toll样受体
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 缩略词14-15
• 前言15-18
• 第一部分：TLRs 激活对体外胎鼠皮质神经元细胞存活的影响18-28
• 材料和方法18-21
• 结果21-25
• 讨论25-28
• 第二部分：TLRs 介导的胎鼠皮质神经元 GLUTs 和 MCTs 表达变化28-43
• 材料和方法28-33
• 结果33-41
• 讨论41-43
• 第三部分：TLRs 介导的胎鼠皮质神经元 GLUTs 和 MCTs 表达下调的相关分子机制初探43-56
• 材料和方法43-49
• 结果49-54
• 讨论54-56
• 全文总结56-57
• 参考文献57-62
• 文献综述62-70
• 参考文献67-70
• 致谢70

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本文编号：614740