P选择素、P选择素糖蛋白配体-1在大鼠深静脉血栓模型中的表达变化初步研究

发布时间：2017-08-03 18:11

  本文关键词：P选择素、P选择素糖蛋白配体-1在大鼠深静脉血栓模型中的表达变化初步研究

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【摘要】：[目的] 1.建立大鼠深静脉血栓模型,并观察不同时间段下血栓形成的状态。 2.检测大鼠DVT模型血液、下腔静脉壁组织中P-selectin、PSGL-1的mRNA、蛋白表达,初步探讨P-selectin、PSGL-1表达变化与DVT形成过程的相关性。 3.采用生物信息学P-selectin、SGL-1与调控白细胞黏附并促进血栓形成间的联系,使进一步更有针对性的研究白细胞粘附的分子机制在血栓形成中的作用提供实验依据。 [材料与方法] 1.将88只SD大鼠参照随机分组原则分为对照组(n=8)、假手术组(n=40)和实验组(n=40),其中对照组不进行任何处理；实验组采用下腔静脉部分瘀滞法(狭窄法)制备深静脉血栓模型；假手术组在分离下腔静脉后,用结扎线将静脉勒紧后立刻放开。分别于造模后6h、24h、48h、72h及7d共5个时间点,在每个时间点各将8只造模后的大鼠过量麻醉后(肾静脉以上)行下腔静脉采血,将获得的大鼠抗凝全血一部分保存于RNALock血液RNA稳定剂内,用PCR法检测TF、PSGL-1及P-selectin的基因表达；另一部分抗凝全血离心后分离出血浆置于-80℃,用ELISA法检测PSGL-1及P-selectin在血液中的表达；同时留取距结扎线1.0cm的下腔静脉及其内容物并分成两份,一份置于4%多聚甲醛中送组织病理检测,另一部分将静脉壁分离出来后立刻置于液氮罐中用于Western-Blot检测。 2.肉眼大致观察血栓状态,判断标准：开腹后见造模段下腔静脉颜色、肿胀程度、局部组织反应程度、血管腔内是否有可见的凝块状物质。 3、对大鼠的静脉组织行组织病理切片后HE染色,观察不同时间点静脉内血栓形成情况。 4.用Kit法提取血液总RNA, RT-PCR将各组大鼠血液RNA逆转录为cDNA,应用Primer5.0软件设计引物,以GAPDH为内参照,用Real-time PCR法检测PSGL-1及P-selectin基因的表达定量。 5.ELISA法分别检测血液内PSGL-1及P-selectin的表达量；Western-Blot法检测静脉壁组织内PSGL-1的表达变化。 6.分析探讨血栓形成过程中PSGL-1及P-selectin的表达与白细胞、内皮细胞粘附,促进血栓形成间的作用关系。 [结果] 1.实验组大鼠DVT模型建立后6h、24h、48h、72h及7d较对照组观察,均可见明显肉眼血栓形成,静脉壁管壁内可见血栓组织形成；HE组织染色显示在造模后6h起,大鼠下腔静脉中均有大部分的血栓形成,24h时间点可见完全性血栓形成,部分与血管壁粘连；血栓内主要为血小板梁、纤维素和红细胞,并可见不同程度的炎细胞侵润；72h至7d时间点除上述病理表现外,同时可见明显血管壁内的炎细胞明显侵润；对照组及假手术组组织切片未见异常。 2.实验组大鼠PSGL-1及P-selectin mRNA在血液白细胞中的表达呈增高总趋势,其中6h、24h均呈升高的趋势(P0.05),72h及7d与对照组比较无明显变化(P0.05),48h组其表达量与6h、24h组比较虽呈下降趋势但无明显变化(P0.05)但较对照组表达仍呈升高趋势；72h、7d组较48h组虽有下降趋势,但与较对照组比较无有统计学意义(P0.05)。所有对照组与假手术组比较表达无明显差异(P0.05)。 3.实验组PSGL-1及P-selectin蛋白在血液内的表达呈先升高后逐渐下降趋势,于造模后6h开始升高趋势(P0.05),24h达到高峰,7d时呈下降减弱趋势(P0.05)；大鼠静脉壁组织Western-Blot检测PSGL-1结果显示DVT模型6h、24h组大鼠较对照组表达呈升高趋势(P0.05),至48h仍有升高趋势且具有统计学意义(P0.05),72h和7d虽有升高趋势但与对照组比较无明显统计学意义(P0.05)；所有对照组与假手术组比较表达无明显差异(P0.05)。 4.生物信息学分析表明：白细胞膜表面表达的PSGL-1(配体)与内皮细胞膜上表达的P-selectin(受体)相互间发生结合,使内皮细胞与单核细胞发生粘附,从而激活了活内皮细胞中的ERK通路及胞核内NF-kB信号通路,MCP-1、TF等分泌增加,进而促进血栓形成。 [结论] 1.大鼠下腔静脉部分瘀滞法(狭窄法)建立大鼠DVT模型6h可形成完全血栓。 2.大鼠DVT模型血液中P-selectin、PSGL-1的mRNA.蛋白表达变化与血栓形成进程相关。 3. PSGL-1、P-selectin的相互作用可调控单核细胞与内皮细胞的起始粘附过程,并能激活ERK及NF--kB信号通路使TF表达升高,从而加速血栓的形成。
【关键词】：组织因子 P选择素糖蛋白配体1 P选择素 深静脉血栓
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R543.6;R-332
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 中英文缩略词表11-12
• 前言12-17
• P-selectin、PSGL-1在大鼠深静脉血栓模型中的表达变化17-38
• 一、DVT大鼠模型建立及取材17-20
• 二. 大鼠下腔静脉组织的组织切片及HE染色20-22
• 三. Real-time PCR检测DVT大鼠血液中P-selectin、PSGL-1的表达22-32
• 四. ELISA检测P-selectin、PSGL-1在血液中的表达变化32-34
• 五. Western-blot检测PSGL-1在静脉壁中的表达变化34-37
• 六. 生物信息学技术分析P-selectin、PSGL-1与血栓形成间的关系37
• 七.统计分析37-38
• 结果38-48
• 1. 动物建模结果38-40
• 2、Real-time PCR检测大鼠DVT模型时P-selectin、PSGL-1在血液白细胞中的表达40-43
• 3、TF、P-selectin、PSGL-1 ELISA检测结果43-45
• 4、Western-blot检测下腔静脉壁组织PSGL-1的表达45-46
• 5. Pathway分析结果46-48
• 讨论48-56
• 结论56-57
• 参考文献57-62
• 综述62-70
• 参考文献66-70
• 在读期间基本情况70-71
• 致谢71

【参考文献】

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本文编号：615649