人类博卡病毒-1型启动子分析及非结构蛋白NS1反式作用的研究
发布时间:2017-08-04 07:15
本文关键词:人类博卡病毒-1型启动子分析及非结构蛋白NS1反式作用的研究
更多相关文章: HBoV1 启动子 NS1 反式作用 正调控 细胞内定位
【摘要】:人类博卡病毒-1(Human bocavirus1, HBoV1)归类于细小病毒科,细小病毒亚科,博卡病毒属。基因组全长约5.5kb,含左端唯一启动子,编码两个非结构蛋白NS1(nonstructural protein)和NP1(nuclear phosphoprotein),两个结构蛋白VP1(vira1structural protein1)与VP2(viral structural protein2)。NP1是博卡病毒的特有蛋白,对其研究已经取得一定的进展,如存在一个非典型的核定位信号,调节炎症因子的表达,诱导细胞凋亡等等。但作为在病毒感染细胞后最先被转录和翻译且对其基因组复制必须的非结构蛋白NS1,却研究甚少。 本课题对我们前期研究中分离到的武汉HBoV1病毒株(pWHL-1NCBI GeneB ank:GU139423)的启动子及NS1进行了初步研究。将全长252nt的启动子截短突变,运用双荧光素酶报告系统检测各截短突变的表达活性。结果显示,在96-145nt内有一些可能的转录因子结合位点,对启动子的活性有重要的影响,而146-196nt为启动子的核心区域。对96-145nt内的部分核心元件进行点突变后,发现CAAT-box的突变会导致启动子的活性显著降低,而TATA-box及CREB、CdxA两个可能的转录因子结合位点的突变对其活性却无显著影响。同样运用双荧光素酶报告系统探究了HBoV1的NS1对自身启动子及转录因子AP-1、NF-κB、STAT3和GAS启动子的正调控活性,发现NS1的274-379aa为反式作用的关键性区域,AP-1、NF-κB、STAT3启动子受NS1的调控,对GAS启动子活性并无显著影响。并将NS1基因全长及截短克隆到pEGFP-N1载体中,研究其在细胞内的定位,证实在180-274aa内有入核信号(NuclearImport Signal, NLS),340-562aa内有核输出信号(Nuclear Export Signal, NES)。 HBoV1启动子的分析、NS1对自身启动子正调控活性及NS1在细胞内定位的研究结果,为病毒蛋白的表达及其复制机制提供了参考数据;并首次发现NS1对NF-κB、AP-1、STAT3这几种涉及炎症反应的主要转录因子启动子具有正调控作用,揭示了NS1可能与HBoVl的致病性有关,为进一步研究HBoV1致病的分子机制提供了参考。
【关键词】:HBoV1 启动子 NS1 反式作用 正调控 细胞内定位
【学位授予单位】:华中师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R373
【目录】:
- 摘要6-7
- Abstract7-11
- 第一章 前言11-19
- 1.1 病毒结构11-13
- 1.2 流行病学13
- 1.3 混合感染13-14
- 1.4 传播14
- 1.5 感染靶标器官和发病机理14-15
- 1.6 持续感染15
- 1.7 诊断15-16
- 1.8 风险因素16
- 1.9 治疗16-17
- 1.10 小结17
- 1.11 PEGFP真核表达系统17-18
- 1.12 双荧光素酶报告系统18-19
- 第二章 实验材料19-23
- 2.1 载体、菌株与细胞系19
- 2.2 试剂19
- 2.3 实验所需各种抗生素19-20
- 2.4 实验用各种溶液20-21
- 2.4.1 LB液体培养基20
- 2.4.2 LB固体平板及抗性筛选平板制备20-21
- 2.4.3 DMEM细胞培养基配制21
- 2.4.4 PBS缓冲液配制21
- 2.4.5 胰蛋白酶溶液配制21
- 2.5 引物设计21-23
- 2.5.1 HBoV突变引物设计21-22
- 2.5.2 NS1截短引物设计22-23
- 第三章 实验方法23-27
- 3.1 HBoV1启动子及各截短突变表达活性的检测23
- 3.2 检测HBoV1启动子在其它哺乳动物细胞系中的活性23
- 3.3 HBoV1启动子全长及各截短突变的活性检测23-24
- 3.4 HBoV1启动子各点突变的的克隆及活性检测24-25
- 3.5 NS1对HBoV1启动子的调控作用25-26
- 3.6 NS1的亚细胞定位26-27
- 第四章 实验结果27-42
- 4.1 HBoV1启动子在哺乳动物细胞中的活性27-28
- 4.2 HBoV1启动子在293T细胞内的高表达活性28-30
- 4.3 HBoV1启动子关键区域的鉴定分析30-34
- 4.5 NS1蛋白对HBoV1启动子的反式作用活性34-37
- 4.6 NS1对炎症相关因子的调节37-39
- 4.7 NS1在细胞内的定位39-42
- 第五章 结果讨论42-44
- 参考文献44-54
- 硕士期间发表论文54-55
- 致谢55
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 李京京;孙彬;欧阳锦凤;陈莹;韩虎;刘凯于;李毅;;人类博卡病毒HBoV1基因组克隆及启动子活性分析[J];生物工程学报;2011年06期
2 孙彬;李永淑;董衍明;刘凯于;杨勇波;李毅;;人博卡病毒HBoV1非结构蛋白NP1对细胞转录因子的调控[J];微生物学报;2013年07期
,本文编号:618256
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