高渗敏感烟曲霉T-DNA插入突变体的筛选和相关基因与致病力的关系研究

发布时间：2017-08-04 16:13

  本文关键词：高渗敏感烟曲霉T-DNA插入突变体的筛选和相关基因与致病力的关系研究

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【摘要】：烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是自然环境中广泛存在的腐生真菌，分生孢子体积较小（直径为2～3μm），可以经空气播散且存活时间较长。人体每天吸入几百个烟曲霉分生孢子，这些孢子可以经鼻腔、气管到达支气管末端和肺泡。 机体免疫功能健全的情况下，非特异性和特异性免疫应答可以有效清除这些孢子。然而，近些年随着临床上骨髓移植、器官移植以及化学药物治疗的开展，白血病、囊泡性纤维化、感染HIV等患者的增加，类固醇类激素、糖皮质激素和免疫抑制剂的使用导致机体免疫功能受损，防御能力降低，无法抵御烟曲霉分生孢子的黏附和侵袭，致使烟曲霉引起的感染病死率一直在50%以上。 1、利用根癌农杆菌介导的遗传转化体系获得烟曲霉T-DNA插入突变体 根癌农杆菌携带有一个肿瘤诱导质粒（tumor-inducing plamid，Ti质粒）。根癌农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒的基因片段即T-DNA（transfer DNA）能够随机整合到宿主染色体，导致细胞生长调控失衡，形成冠瘿瘤。质粒上的毒力基因在侵染过程中编码毒力蛋白，负责单链T-DNA的形成、转移和随机插入基因组。利用根癌农杆菌介导的遗传转化体系（Agrobacterium tumefaciens-mediatedT-DNA insertional mutagenesis，ATMT）获得3205株烟曲霉T-DNA插入突变体（Aspergillus fumigatus insertion mutants，，AFM），每一个突变体都相当于一个基因敲除株，T-DNA插入突变缺失位点多为单拷贝，HI-TAILPCR和BLAST方法可以定位插入位点相关基因，从而为研究基因功能提供菌株资源。 2、筛选高渗敏感烟曲霉T-DNA插入突变体 利用由无机盐离子NaCl构成高渗透压力，平板法筛选在1.25M NaCl浓度下较野生型菌落直径减小、分生孢子生成障碍等表型发生改变的T-DNA插入突变体，总共从2086株中筛选出320株，建立高渗敏感烟曲霉T-DNA插入突变体亚库。其中108株突变体通过HI-TAIL-PCR和BLAST确定插入突变基因，分析结果这些基因渗透压感受、膜通道、能量代谢和细胞周期等相关。 3、构建烟曲霉金属平衡蛋白bsd2基因敲除株和回复突变株 AFM3217在1.25M NaCl浓度下表现为菌落直径减小、白化，分生孢子生成减少。HI-TAIL-PCR和BLAST比对确定打断的序列位于bsd2基因上游启动子区域的TATA盒，阻碍了转录因子与启动子区域的结合，导致bsd2基因不能表达。bsd2基因敲除株与AFM3217表型基本一致，回复突变株与野生型表型基本一致。 4、致病力和药物敏感性实验 烟曲霉秀丽隐杆线虫感染模型显示与野生型相比，AFM3217的致病力明显下降。采用美国国家临床试验室标准化委员会（CLSI，原NCCLs）颁布的微量稀释法方案（M38-A2），结果显示AFM3217对氟康唑（fluconazole，FCZ）、伊曲康唑（itraconazole，ITC）、伏立康唑（voriconazole，VCZ）、泊沙康唑（posaconazole，POS）、两性霉素B（amphotericin B，AMB）、卡泊芬净（caspofungin，CAS）、特比萘芬（terbinafine，TRB）和匹马毒素（pimagedine，PIM）的敏感性与野生型无明显差异。
【关键词】：烟曲霉 高渗胁迫 T-DNA 致病力
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R379
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 绪论13-21
• 1.1 烟曲霉和烟曲霉感染13-14
• 1.1.1 烟曲霉的分类学地位和生物学特性13-14
• 1.1.2 烟曲霉引起的机体感染14
• 1.2 烟曲霉致病因子和致病机制的研究现状14-16
• 1.2.1 烟曲霉致病因子的研究现状15-16
• 1.2.2 烟曲霉致病机制的研究进展16
• 1.3 渗透压应激在烟曲霉感染中的作用机制16-20
• 1.3.1 烟曲霉感染机体时面临的应激反应16-17
• 1.3.2 高渗透压应激的研究进展17-20
• 1.4 本研究的目的和意义20-21
• 第2章 利用根癌农杆菌介导的遗传转化体系（ATMT）获得烟曲霉T-DNA 插入突变体21-27
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 菌株21
• 2.1.2 培养基21-22
• 2.1.3 试剂22-23
• 2.1.4 仪器设备23
• 2.2 方法23-25
• 2.2.1 烟曲霉 IFM40808 分生孢子悬浊液的制备23-24
• 2.2.2 根癌农杆菌 AGL-1 的活化和诱导培养24
• 2.2.3 烟曲霉 IFM40808 与根癌农杆菌 AGL-1 共培养24
• 2.2.4 转化获得烟曲霉 T-DNA 插入突变体24-25
• 2.3 结果25
• 2.4 讨论25-27
• 第3章 建立高渗敏感烟曲霉 T-DNA 插入突变体亚库27-30
• 3.1 材料27-28
• 3.1.1 菌株27
• 3.1.2 试剂27
• 3.1.3 仪器设备27-28
• 3.2 方法28
• 3.2.1 烟曲霉 IFM40808 在不同 NaCl 浓度构成的高渗透压条件下的生长状态28
• 3.2.2 高渗透压培养基筛选敏感烟曲霉 T-DNA 插入突变体28
• 3.2.3 高渗敏感烟曲霉 T-DNA 插入突变体的形态学观察28
• 3.3 结果28-29
• 3.4 讨论29-30
• 第4章 高渗敏感烟曲霉 T-DNA 插入突变体的分子分析30-42
• 4.1 材料30-31
• 4.1.1 菌株30
• 4.1.2 试剂30
• 4.1.3 仪器设备30-31
• 4.2 方法31-35
• 4.2.1 高渗透压敏感烟曲霉 T-DNA 插入突变体基因组 DNA 的提取31-32
• 4.2.2 HI-TAIL PCR 扩增烟曲霉 T-DNA 突变体的侧翼序列32-35
• 4.2.3 HI-TAIL-PCR 产物测序35
• 4.3 结果35-39
• 4.3.1 烟曲霉 T-DNA 插入突变体 PCR 检测 hph35-36
• 4.3.2 HI-TAIL PCR 扩增 T-DNA 插入突变体侧翼序列36
• 4.3.3 高渗敏感烟曲霉 T-DNA 插入突变体36-38
• 4.3.4 功能基因分析38-39
• 4.4 讨论39-42
• 第5章 构建烟曲霉 BSD2 基因敲除株和回复突变株42-61
• 5.1 材料42
• 5.1.1 菌株42
• 5.1.2 试剂42
• 5.1.3 培养基42
• 5.1.4 仪器设备42
• 5.2 生物信息学分析 AFM3217 的插入突变位点42-43
• 5.3 RT- PCR 验证 BSD2 的转录水平43-45
• 5.3.1 设计特异性引物43
• 5.3.2 提取 IFM40808 和 AFM3217 的总 RNA43-44
• 5.3.3 逆转录反应合成 cDNA44-45
• 5.3.4 RT-PCR 反应45
• 5.4 构建 BSD2 的基因缺失株和回复突变株45-57
• 5.4.1 构建 bsd2 基因敲除株45-52
• 5.4.2 构建 bsd2 基因回复突变株52-57
• 5.5 野生型，AFM3217，BSD2 基因敲除株和回复突变株生物学性状比较57
• 5.6 结果57-60
• 5.7 讨论60-61
• 第6章 烟曲霉秀丽隐杆线虫感染实验和药物敏感性实验61-65
• 6.1 材料61-62
• 6.1.1 菌株61
• 6.1.2 培养基61-62
• 6.2 仪器设备62
• 6.3 方法62
• 6.3.1 大肠杆菌 OP50 菌液的制备：62
• 6.3.2 秀丽隐杆线虫的培养：62
• 6.4 烟曲霉秀丽隐杆线虫感染模型的建立62
• 6.5 药物敏感性实验62-63
• 6.5.1 菌悬液制备62
• 6.5.2 微量稀释法检测待测 IFM40808 和 AFM3217 对抗真菌药物的敏感性62-63
• 6.6 结果63-64
• 6.6.1 秀丽隐杆线虫致病模型63
• 6.6.2 最低抑菌浓度（MIC）的判定63-64
• 6.7 讨论64-65
• 第7章 结论65-66
• 参考文献66-78
• 在学期间取得的科研成果78-79
• 致谢79

【共引文献】

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1 程娜;晓军;赵民安;张文明;姚大年;;农杆菌介导遗传转化宿主的研究进展[J];安徽农业科学;2006年24期

2 陈东亮;李纪元;范正琪;范妙华;;根癌农杆菌介导真菌遗传转化的影响因素及应用[J];安徽农业科学;2010年07期

3 胡凯;王微;;紫杉二烯合成酶基因转化红豆杉内生真菌XT5的研究[J];安徽农业科学;2011年02期

4 陈凤;王坤;银超;李德明;任楠;李俊星;;根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统的构建[J];安徽农业科学;2012年16期

5 杨丰科;姜萍;李思东;王守满;;丝状真菌基因工程进展[J];氨基酸和生物资源;2009年01期

6 乔建军;刘伟;马彦;万U

本文编号：620486