筛选与CVB3 VP3蛋白相互作用的人细胞蛋白

发布时间：2017-08-06 13:29

  本文关键词：筛选与CVB3 VP3蛋白相互作用的人细胞蛋白

  更多相关文章： 柯萨奇病毒 VP3 质粒构建 酵母双杂交系统

【摘要】：目的： 从人心脏cDNA文库中筛选出与CVB3VP3蛋白相互作用的人细胞蛋白。 方法： 1.采用PCR技术扩增出VP3基因，将其插入到真核表达质粒pGBKT7中构建重组诱饵质粒pGBKT7-VP3； 2.采用乙酸锂法将pGBKT7-VP3转化至酵母菌AH109中，通过表型鉴定、PCR法验证质粒pGBKT7-VP3是否转化至酵母菌中； 3.利用Western blot检测酵母菌AH109[pGBKT7-VP3]中VP3蛋白的表达； 4.利用营养缺陷培养基以及酶底物X-α-Gal的变化情况检测VP3基因对报告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的转录自激活作用； 5.经小规模配合试验检测VP3蛋白对酵母菌配合功能的影响； 6.利用大规模酵母配合实验筛选人心脏cDNA文库； 7.经阳性克隆的表型确定、PCR扩增cDNA插入片段和Alu I酶切等试验将阳性克隆归类，并进行测序和同源性比对分析； 8.采用α-半乳糖苷酶定量分析VP3蛋白与各阳性蛋白之间相互作用的强弱； 9.利用营养缺陷培养基以及酶底物X-α-Gal的变化情况检测阳性文库质粒pGADT7-ADx对报告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的转录自激活作用； 10.利用回返配合试验对筛出的各阳性蛋白与VP3蛋白的相互作用再次进行验证。 结果： 1.双酶切及序列分析提示VP3基因已成功插入pGBKT7载体的多克隆位点，并且阅读框与病毒VP3基因一致； 2.表型鉴定和PCR法验证pGBKT7-VP3质粒已成功转入酵母菌AH109中； 3. Western blot证实酵母菌AH109[pGBKT7-VP3]能表达VP3蛋白； 4.营养缺陷型培养基和酶底物X-α-Gal变化情况显示VP3蛋白对报告基因无转录自激活作用； 5.小规模配合试验表明VP3蛋白在AH109的表达基本不影响酵母菌正常的配合功能。 6.以CVB3VP3为诱饵蛋白，从人心脏cDNA文库中筛选到50个阳性候选克隆； 7.经阳性候选克隆的初步分析将阳性克隆归为10类，，并经测序和同源性比对，最后共获得10种不同类别的阳性蛋白：线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）、内质网-高尔基体中间室蛋白1（ERGIC1）、真核翻译起始因子4A2（EIF4A2）、肌钙蛋白I3型（TNNI3）、平滑肌蛋白3（LMOD3）、羟酰辅酶A脱氢酶三官能蛋白转录变体3（HADHB）、门冬酰胺酶同系物（ASPG）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、肌肉型肌酸激酶（CKM）、骨骼肌α1肌动蛋白(ACTA1)。 8. α-半乳糖苷酶定量试验进一步证明了筛选出的10种阳性蛋白与VP3蛋白均有较强的相互作用； 9.筛选出的10种阳性蛋白对报告基因无转录自激活作用； 10.回返配合试验再次验证10种阳性蛋白与VP3蛋白存在相互作用。 结论： 1.成功构建了重组质粒pGBKT7-VP3； 2. CVB3VP3蛋白是一个适合用于酵母双杂交系统的诱饵蛋白； 3.以CVB3VP3为诱饵蛋白，应用大规模酵母配合实验，从人心脏cDNA文库中获得10种与VP3蛋白发生相互作用的人细胞蛋白：ALDH2、ERGIC1、EIF4A2、TNNI3、 GAPDH、LMOD3、HADHB、ASPG、CKM、ACTA1；
【关键词】：柯萨奇病毒 VP3 质粒构建 酵母双杂交系统
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-12
• 第1章 引言12-17
• 1.1 柯萨奇病毒 B 组 3型（Coxsackievirus group B type 3,CVB3）12-14
• 1.2 VP3 蛋白14
• 1.3 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system,YTS)14-16
• 1.4 本论文研究基础和研究意义16-17
• 第2章 材料与方法17-41
• 2.1 材料17-25
• 2.2 实验方法25-41
• 2.2.1 pGBKT7-VP3 重组质粒的构建（如图 2.1）25-31
• 2.2.2 pGBKT7-VP3 重组质粒在酵母菌 AH109 中的表达31-33
• 2.2.3 检测 DNA-BD-c-Myc-VP3 融合蛋白对报告基因的转录自激活33-34
• 2.2.4 检测 DNA-BD-c-Myc-VP3 融合蛋白对酵母菌配合的影响34
• 2.2.5 大规模酵母配合实验34-36
• 2.2.6 阳性候选克隆的初步分析36-38
• 2.2.7 α-半乳糖苷酶定量分析蛋白质-蛋白质相互作用的强弱38-40
• 2.2.8 检测筛选出的 10种阳性蛋白对报告基因的转录自激活作用40
• 2.2.9 回返配合实验40-41
• 第3章 结果41-53
• 3.1 VP3 基因的扩增41
• 3.2 重组质粒 pGBKT7-VP3 的酶切分析41-42
• 3.3 重组质粒 pGBKT7-VP3 的基因测序42
• 3.4 AH109 菌株的表型验证42
• 3.5 阳性酵母菌 AH109[pGBKT7-VP3]的表型验证42-43
• 3.6 阳性酵母菌 AH109[pGBKT7-VP3]中 VP3 基因的验证43
• 3.7 VP3 融合蛋白表达的检测43-44
• 3.8 检测 VP3 融合蛋白对报告基因的转录自激活作用44-45
• 3.9 DNA-BD-c-Myc-VP3 蛋白对酵母配合功能影响的检测45
• 3.10 人心脏 cDNA 文库滴定45
• 3.11 阳性候选克隆酶切归类45-46
• 3.12 DNA序列测定和同源性分析46-48
• 3.13 VP3 蛋白与 10种阳性蛋白相互作用强弱的分析48-50
• 3.14 筛选出的 10种阳性蛋白对报告基因的转录自激活作用50-52
• 3.15 VP3 蛋白与 10种阳性蛋白相互作用的进一步验证52-53
• 第4章 讨论53-60
• 4.1 质粒构建载体的选择53-54
• 4.2 VP3 蛋白作为诱饵蛋白的可行性54
• 4.3 研究与 VP3 蛋白相互作用蛋白的方法选择54-55
• 4.4 与 VP3相互作用的 10 种人细胞蛋白55-60
• 4.4.1 TNNI355-56
• 4.4.2 ALDH256-57
• 4.4.3 ERGIC157
• 4.4.4 CKM57-58
• 4.4.5 EIF4A258
• 4.4.6 ACTA158
• 4.4.7 LMOD358-59
• 4.4.8 HADHB59
• 4.4.9 GAPDH59
• 4.4.10 ASPG59-60
• 第5章 结论与展望60-61
• 5.1 结论60
• 5.2 展望60-61
• 致谢61-62
• 参考文献62-69
• 附图69-70
• 攻读学位期间的研究成果70-71
• 综述71-78
• 参考文献76-78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 刘发娣;余克花;罗达亚;徐秋芳;莫冰;罗军;刘晶星;黄孝天;;酵母双杂交技术筛选与CVB3 VP1直接作用的细胞蛋白[J];中国人兽共患病学报;2009年10期

2 陈婉南;刘玲玲;吴云丽;焦伯延;林万松;林旭;;酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白[J];中国人兽共患病学报;2010年10期

3 张国寿;罗顺峰;吴燕斌;池闽辉;刘景丰;;酵母双杂交法筛选与受翻译调节的肿瘤蛋白相互作用的蛋白[J];肿瘤;2011年09期

4 李柏岩,乔国芬,周宏,李文汉,黄志刚,周令望;细胞内游离钙与柯萨奇病毒B_3诱导的大鼠培养心肌细胞凋亡(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;1999年05期

本文编号：630063