病原微生物的基于熔解曲线的最小化多位点序列分型

发布时间：2017-08-06 13:03

  本文关键词：病原微生物的基于熔解曲线的最小化多位点序列分型

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【摘要】：病原微生物引起的传染性疾病是全球公共卫生领域面临的严峻课题。通过病原微生物分型,可实现对病原微生物的流行病学调查、跟踪和阻断传播途径以遏制其暴发流行。理想的病原微生物分子分型技术,应具有分型能力强、操作简便、重复性好、准确快速、高通量自动化、成本低廉的特点。本论文以沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为模型,建立了一种新型的数字化病原微生物分子分型技术-基于熔解曲线的最小化多位点序列分型(minim McMLST)。 第一章,阐述了病原微生物分型的意义。探讨了目前病原微生物分型技术的研究现状,重点介绍和比较了各种核酸指纹分型技术的优缺点,总结了一个理想分型技术应具备的特点。最后,在多位点序列分型技术(MLST)和多色熔解曲线分析(MMCA)的基础上,提出了minim McMLST方法,本方法可利用MLST序列型(STs)中最少的单核苷酸多态性(SNPs)位点达到病原微生物分型的目的。 第二章,首先详细的阐述了minim McMLST方法的分型原理。然后以沙门氏菌为模型,对minim McMLST技术的可行性进行了初步的研究,建立了双反应三重荧光PCR的沙门氏菌分型体系。利用Minimum SNPs软件对1560个STs进行分析,共筛选出6个具有显著分型能力的SNPs位点,另外,人工添加了1个SNP位点,用于区分中国最流行的两种STs。理论上,这7个位点可将1560个STs分成了59种熔解类型(MTs)。本体系的特异性高,重复性好,检测下限可达到5copies/反应。对167份标本进行检测,共发现17种MTs。测序验证了52份代表菌株,分析显示,探针覆盖区与测序结果完全一致。利用PHYLIP软件的非加权组平均法(UPGMA)对52份标本构建了系统发育树,直观显示出,本方法获得了17种MTs,而MLST方法获得了23种STs。相对于MLST方法,计算出本方法的Simpson's index of diversity (D)等于0.9818。 第三章,在上述基础上通过进一步增加SNPs位点的选择,探讨提高minim McMLST分辨率的途径。我们以金黄色葡萄球菌为模型,建立了三管三重的金黄色葡萄球菌分型体系。该体系所检测的SNPs位点增至15个,理论上可将2151个序列型分成288种MTs。实验检测了376份标本,获得29种MTs。测序验证的70份代表菌株显示,探针覆盖区与测序结果完全一致。利用PHYLIP的UPGMA算法构建了系统发育树,结果表明,本方法获得了24种MTs,而MLST方法获得了29种STs。相对于MLST方法,计算出D值为0.9884。进一步利用goeBURST-1.2.1对70份菌株进行了克隆谱系分析,我们的方法未区分的菌株在MLST中均被划分到了相同的克隆群中,其溯源分析能力与MLST开始趋于一致。标本的分型正确率为97.19%。最后,通过对376标本的耐药状态检测,我们观察到熔解类型与菌株的甲氧西林耐药性表现出明显的相关性,因此,基因分型对临床用药具有潜在的指导价值。
【关键词】：基于熔解曲线的最小化多位点序列分型 单核苷酸多态性 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 D值
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R372
【目录】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 第一章 绪论14-24
• 第一节 病原微生物的分型现状15-18
• 1.1 表型分型技术介绍15
• 1.2 核酸指纹分型技术介绍15-18
• 第二节 论文研究的目的、内容及意义18-20
• 参考文献20-24
• 第二章 沙门氏菌的基于熔解曲线的最小化多位点序列分型24-58
• 第一节 基于熔解曲线的最小化多位点序列分型24-27
• 1.1 minim McMLST技术的原理和流程24-26
• 1.2 minim McMLST设计原则26-27
• 1.3 Simpson's index of diversity27
• 第二节 沙门氏菌的简介27-29
• 第三节 材料和方法29-37
• 3.1 实验菌株29
• 3.2 菌株培养和基因组DNA的提取29
• 3.3 SNPs位点的筛选29-30
• 3.4 探针和引物的设计30-34
• 3.5 两管三重分型体系的建立34
• 3.6 体系灵敏度34
• 3.7 标本检测34
• 3.8 标本测序验证34-35
• 3.9 统计学分析35-37
• 第四节 结果与分析37-51
• 4.1 探针与靶序列的预杂交实验37
• 4.2 两管三重分型体系的建立和优化37-43
• 4.3 等位基因图谱43-44
• 4.4 体系灵敏度44-45
• 4.5 标本检测45-47
• 4.6 标本测序验证47-49
• 4.7 minim McMLST与MLST分型结果的比较49-51
• 第五节 讨论51-54
• 参考文献54-58
• 第三章 金黄色葡萄球菌的基于熔解曲线的最小化多位点序列分型58-98
• 第一节 金黄色葡萄球菌的简介58-60
• 第二节 材料和方法60-68
• 2.1 实验菌株60
• 2.2 菌株培养和基因组DNA的提取60-61
• 2.3 SNPs位点的筛选61
• 2.4 探针和引物的设计61-65
• 2.5 三管三重分型体系的建立65
• 2.6 体系灵敏度65
• 2.7 标本检测65
• 2.8 标本测序验证65-66
• 2.9 统计学分析66-68
• 第三节 结果与分析68-91
• 3.1 探针与靶序列的预杂交实验68-69
• 3.2 三管三重分型体系的建立和优化69-70
• 3.3 体系灵敏度70-83
• 3.4 等位基因图谱83-84
• 3.5 标本检测84-85
• 3.6 标本测序验证85-88
• 3.7 minim McMLST与MLST分型结果的比较88-91
• 第四节 讨论91-93
• 参考文献93-98
• 英文缩写索引98-99
• 致谢99-100

【参考文献】

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本文编号：629915