新型双功能糖苷酶的表达纯化及功能研究

发布时间：2017-08-06 16:11

  本文关键词：新型双功能糖苷酶的表达纯化及功能研究

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【摘要】：目的：抗体的糖型对抗体的功能有着极其重要的影响，PNGase F和Endo F2是糖苷酶家族中的重要成员，在抗体和抗体糖型的鉴定中发挥着重要作用，但这两种酶的酶切最适pH值差异巨大，无法在同一pH的缓冲液下进行抗体单步酶切，并且PNGase F无法切除位于抗体Fab段的糖链。若抗体在多个部分有糖基化修饰，那么就要两种酶进行多步酶切，而这会对后期抗体及其糖型的检测造成不可控的影响，如何在同一pH下使两种酶均能发挥作用目前尚未有研究。 方法：分别通过全基因合成得到PNGase F及Endo F2基因片段，采用大肠杆菌进行表达，纯化过后得到了PNGase F及Endo F2，然后通过晶体模拟及蛋白参数的运算，决定采用融合蛋白的方式来完成Endo F2的pH shift，确定了通过串联两段基因进行表达的可行性，将Endo F2及PNGase F基因串联片段克隆到pET32a+载体上，并诱导大肠杆菌表达获得大量重组可溶性的糖苷酶，进而采用两步纯化，得到具有活性的高纯度“融合酶”。采用该酶进行抗体酶切，并通过质谱及SDS-PAGE来进一步确定“融合酶”pH shift的有效性。 结果：通过串联表达构建的“融合酶”不但实现了可溶性表达，可以应用于宽泛的pH范围，，可在同一pH缓冲液中同时发挥两种酶的作用，并且可以在非变性的条件下有效地切除抗体中FC及Fba上的糖链，具有很好的脱糖基的作用。 结论： Endo F2和PNGase F融合表达后，形成了一种新型双功能酶，成功地实现了pH shift。该“融合酶”可在同一pH下良好的发挥相应作用。很好的解决了当抗体中有多个糖基化位点时的酶切鉴定问题。
【关键词】：Endo F2 PNGase F 融合酶 pH shift 脱糖作用
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-8
• 引言8-10
• 第一部分 重组 Endo F2 和 PNGase F 蛋白的表达和纯化10-30
• 1. 材料与方法11-22
• 2. 实验结果22-27
• 3. 讨论27-30
• 第二部分 融合串联 Endo F2-PNGase F 蛋白的表达和纯化30-46
• 1 材料与方法30-39
• 2 实验结果39-44
• 3 讨论44-46
• 第三部分 融合蛋白 Endo F2-PNGase F 的功能检测46-55
• 1 材料与方法46-50
• 2 结果50-53
• 3 讨论53-55
• 结论55-56
• 参考文献56-59
• 综述59-69
• 参考文献65-69
• 攻读学位期间发表的论文69-70
• 缩略词表70-71
• 致谢71-72

【共引文献】

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本文编号：630520