艰难梭菌毒素受体结合区的免疫效应研究

发布时间：2017-08-07 13:19

  本文关键词：艰难梭菌毒素受体结合区的免疫效应研究

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【摘要】：艰难梭菌（Clostridium difficile，C. difficile）是25%以上抗生素相关性腹泻（Antibiotic-associated diarrhea，AAD）的病因。自1978年首次发现该菌与伪膜性肠炎（pseudomembranous colitis，PMC）有关以后引起重视。2003年起核糖体027型（简称RT027）新菌株在多个国家暴发流行，造成大量死亡案例。中国也报道了散发病例。RT027因发生变异，传染性和耐药性增强，造成的死亡率、发病率也高于以往。很多国家包括中国将艰难梭菌作为法定传染病必报的监测病原。疫苗被认为是控制CDI（C.difficile infection）最根本有效的措施。 艰难梭菌最主要的毒力因子是毒素A和毒素B，抑制毒素的作用就能够有效防止感染造成的严重损伤，起到免疫防御的效果。毒素A和毒素B的C-端都由多个重复序列构成，是毒素识别和结合细胞受体的功能区，称为受体结合区（receptor-binding domain，RBD），重复序列的多少直接影响毒素与细胞表面受体的结合力强弱。 艰难梭菌共有24个毒素型（toxinotype），150个核糖型，毒素的变异广泛存在。为最大程度覆盖保护性抗原表位，提供最大限度保护，本文针对标准产毒型菌株（toxinotype0）ATCC43255毒素A和B的全长RBD设计了候选抗原，进行了重组制备（命名为TcdA和TcdB），考察单一或组合免疫后在小鼠中的免疫原性以及对标准株和RT027代表株ATCC BAA1870毒素的保护效应。 第一部分艰难梭菌天然毒素的提取、纯化与鉴定 为验证ATCC43255和ATCC BAA1870的毒素差异，对两株菌毒素A和毒素B的编码基因进行测序分析，表明ATCC BAA1870菌的毒素A和毒素B基因与Genbank公布的两株027型菌（R20291，CD196）同源性均为100%。ATCC BAA1870与ATCC43255的毒素A氨基酸同源性98.15%，与毒素B氨基酸同源性92.18%，两种毒素最保守的是酶活区，受体结合区变异最大。 为获得ATCC43255和ATCC BAA1870的天然毒素A和毒素B，首先用硫酸铵盐析法将培养菌液中的毒素沉淀和浓缩，获得ATCC43255粗毒素80mg/L，ATCCBAA1870粗毒素86.5mg/L。用抗毒素A和抗毒素B鼠单抗经Western blot鉴定能被特异抗毒素抗体识别，毒素相对分子量与文献报道一致。以ATCC43255和ATCCBAA1870粗毒素腹腔注射BALB/C小鼠的MLD分别为360ng和540ng，对Vero细胞的CD50分别为70pg，90pg，与文献报道接近。为获得纯化和精制的毒素A和毒素B，将鉴定正确的粗毒素进行DEAE Sepharose离子交换层析，最终分离得到电泳单一条带的毒素A和毒素B，经Western blot和VIDAS-mini系统鉴定证实能被抗毒素抗体识别和结合。本文建立的艰难梭菌毒素纯化工艺相比文献中报道的凝胶过滤后多步离子交换等方法，过程简化、纯化效率较高。 第二部分毒素受体结合区的制备及其在小鼠模型上的免疫效应研究 艰难梭菌毒素的RBD与受体的结合是毒素发挥毒性的前提条件，抑制RBD的结合就能保护宿主免受毒素损伤。第二部分研究首先针对毒素A和毒素B的全长RBD作为候选抗原进行重组制备，纯化获得纯度90%以上TcdA和TcdB。Western blot结果表明蛋白分子量大小正确，具有抗原性。 以TcdA和/或TcdB为免疫原，以氢氧化铝为免疫佐剂，肌肉途径免疫BALB/C小鼠，基础免疫7d后即产生1：102以上效价水平的抗TcdA和/或TcdB IgG特异抗体，一次加强免疫7d后血清效价最高至1：105。加强免疫后两个月达到高峰，三个月后仍具有1：103以上水平，说明TcdA和TcdB均具有良好的免疫原性。以1μg和10μg两种免疫剂量免疫C57BL/6小鼠，研究不同免疫剂量对小鼠抗体产生数量的影响，发现除TcdA10μg+TcdB10μg与TcdA1μg+TcdB1μg刺激小鼠产生的anti-TcdB抗体有统计学意义的差异外，其他高低剂量抗原诱导产生的抗体水平没有统计学差异。C57BL/6小鼠免疫血清中和抗体效价ED50，1μg免疫组，TcdA、TcdB、TcdA+TcdB中和ATCC43255毒素的效价为：1：4960，1：1196，1：7510，中和ATCC BAA1870毒素的效价为：1：529，1：1223，1：2310；10μg免疫组，TcdA、TcdB、TcdA+TcdB中和ATCC43255毒素的效价为：1：5987，1：1190，1：10643，中和ATCC BAA1870毒素的效价为：1：1563，1：933，1：6410。 在评价TcdA和TcdB的免疫效应时，仍设计TcdA、TcdB、TcdA+TcdB三组免疫原，分两批受试动物（BALB/C、C57BL/6），基础免疫和一次加强免疫后，利用获得的ATCC43255和ATCC BAA1870天然毒素攻毒。实验结果表明：（1）BALB/C小鼠模型中，1MLD剂量攻毒时，对ATCC43255毒素各免疫组保护率100%，对ATCC BAA1870毒素只有TcdA+TcdB组能提供保护率100%，其他组不能提供保护；5MLD剂量攻毒时，对ATCC43255毒素，除TcdB组不能提供保护，其余组保护率均100%，对ATCC BAA1870毒素，各免疫组均不能提供保护；20MLD剂量攻毒时，对ATCC43255毒素，TcdA组和TcdA+TcdB组的保护率分别为60%和80%。（2）C57BL/6模型中，考察免疫剂量（1μg和10μg）与保护效应的关系。1μg免疫剂量，1MLD攻毒时，TcdA，TcdB，TcdA+TcdB对ATCC43255毒素保护率分别均为100%；对ATCC BAA1870保护率分别为：0，100%，100%；3MLD攻毒时，对ATCC43255保护率分别为：100%，40%，100%；对ATCC BAA1870保护率均为0；对5MLD ATCC43255毒素保护率分别为：87.5%，0，75%；对2MLDATCC BAA1870毒素保护率分别为：0，50%，80%。10μg免疫剂量，1MLD攻毒时，TcdA，TcdB，TcdA+TcdB对ATCC43255毒素保护率分别均为100%，对ATCC BAA1870保护率分别为：100%，20%，，100%；3MLD攻毒时，对ATCC43255保护率分别为：100%，20%，100%；对ATCC BAA1870保护率均为0，0，60%；对5MLDATCC43255毒素保护率分别为：75%，0，87.5%；对2MLD ATCC BAA1870毒素保护率分别为：0，0，100%。以相同免疫剂量组比较在两种动物模型中的保护率，C57BL/6的保护效果弱于BALB/C，原因不明确。 综上结果可知，重组制备的TcdA和TcdB均具有良好的免疫原性，可诱导机体产生高滴度抗体IgG，可有效中和毒素A和/或B，两次免疫可为受试动物提供免疫保护作用，TcdA和TcdB同时免疫动物保护效果最好，对RT027代表株ATCC BAA1870攻毒保护水平低于标准株ATCC43255。提示覆盖变异毒素有效抗原表位的疫苗组合抗原设计，可以为不同产毒株的艰难梭菌感染提供更全面的免疫防护。
【关键词】：艰难梭菌毒素 受体结合区 重组表达 免疫效应
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 第一部分 艰难梭菌天然毒素的提取、纯化与鉴定16-34
• 1 材料与方法16-24
• 2 结果24-32
• 3 讨论32-34
• 第二部分 毒素受体结合区的制备及其在小鼠模型上的免疫效应研究34-58
• 1 材料与方法34-41
• 2 结果41-56
• 3 讨论56-58
• 总结58-60
• 参考文献60-63
• 综述63-79
• 参考文献72-79
• 硕士期间发表论文79-90
• 个人简历90-91
• 致谢91

【参考文献】

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本文编号：634851