降钙素基因相关肽对ALI时小鼠巨噬细胞替代激活的影响

发布时间：2017-08-07 16:32

  本文关键词：降钙素基因相关肽对ALI时小鼠巨噬细胞替代激活的影响

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【摘要】：巨噬细胞为免疫系统的主要效应细胞,其在机体中执行的功能由其特定的激活方式决定。巨噬细胞的激活大致分为两种：经典激活和替代激活。其中替代激活在炎症反应后期较为常见,发生替代激活的巨噬细胞通过分泌多种抗炎和促修复介质参与炎症消退与组织修复。体外IL-4可诱导巨噬细胞替代激活,精氨酸酶-1(arginase-1, Arg-1)和IL-10是巨噬细胞替代激活的标志性蛋白。在多种肺部疾病的发生、发展中均存在不同表型巨噬细胞激活的失衡。急性肺损伤(acute lung injury, ALI)时,巨噬细胞替代激活可有效调控炎症反应,加速ALI的损伤修复。因此,寻找促进巨噬细胞替代激活的内外源性物质,对ALI时的瀑布式炎症反应进行及时、有效的干预,对防治ALI的炎症迁延、促进损伤修复意义重要。 降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是肺内含量最为丰富的神经肽。研究表明CGRP主要通过调控炎症介导的巨噬细胞趋化因子和细胞因子的产生,进而发挥对巨噬细胞的免疫功能的调节作用,但其对巨噬细胞替代激活的影响尚未见相关报道。本课题将从整体和细胞水平分别观察小鼠ALI动物模型和LPS应激的小鼠巨噬细胞CGRP的表达变化,并研究CGRP对IL-4诱导的小鼠巨噬细胞替代激活的影响及其可能机制。 目的： 观察ALI时小鼠肺组织内CGRP mRNA表达的变化,探讨CGRP对IL-4诱导的小鼠巨噬细胞替代激活的影响及其可能机制。 方法： 1.动物模型复制：腹腔注射LPS复制小鼠ALI动物模型,采用RT-PCR法分别检测不同时间点小鼠肺内CGRP mRNA的相对表达量。 2.细胞模型复制和时效量效检测：IL-4处理小鼠巨噬细胞(RAW264.7, ATCC:TIB-7TM)复制小鼠巨噬细胞替代激活模型,观察CGRP对小鼠巨噬细胞替代激活的影响。采用RT-PCR法检测各组Arg-1及IL-10mRNA的相对表达。Arg-1相对表达的时效检测：时间点选取IL-4处理后的0h、8h、16h和24h,CGRP浓度为10-7M,预处理时间为1h; Arg-1相对表达的量效检测：IL-4处理时间为24h, CGRP浓度为10-8、5×10-8、10-7和5×10-7M,预处理时间为1h。 3.信号转导机制：采用钙调蛋白信号通路阻断剂(W7)、PKC信号通路阻断剂(H7)、和PKA信号通路阻断剂(H89)预处理,观察CGRP促进IL-4诱导小鼠巨噬细胞Arg-1mRNA表达的胞内信号转导机制。 结果： 1.ALI小鼠肺内CGRPmRNA的表达RT-PCR检测ALI小鼠0h、8h、16h、24h肺内CGRP mRNA水平的相对表达。结果显示：与对照组相比,ALI小鼠肺内CGRP的表达明显增高(P0.05)；8h即达峰值,16h和24h较8h时表达略微降低。 2.LPS应激下小鼠巨噬细胞内CGRP mRNA的表达 LPS处理小鼠巨噬细胞,8h后RT-PCR检测其CGRP mRNA的表达,与对照组相比,LPS处理明显增加CGRP mRNA的表达量(P0.05)。 3. CGRP对IL-4诱导小鼠巨噬细胞替代激活标志分子Arg-1和IL-10mRNA表达的影响 (1) Arg-1:RT-PCR结果显示,CGRP预处理对静息状态小鼠巨噬细胞Arg-1mRNA的表达无影响(P0.05),但可呈时间依赖性(0、8、16、24h)和浓度依赖性(10-8、5×10-8、10-7、5×10-7M)促进IL-4诱导的小鼠巨噬细胞替代激活时Arg-1mRNA的表达(P0.05)。 (2) IL-10:RT-PCR结果显示,静息状态小鼠巨噬细胞IL-10mRNA表达水平较低,CGRP预处理可促进IL-4诱导的小鼠巨噬细胞IL-10mRNA的表达(P0.05)。 4. CGRP促进IL-4诱导小鼠巨噬细胞Arg-1mRNA表达的胞内信号转导机制 RT-PCR检测结果显示：与对照组相比,IL-4可促进小鼠巨噬细胞Arg-1mRNA的表达,CGRP可进一步增加其表达(P0.05)；而钙调蛋白信号通路阻断剂(W7)、PKC信号通路阻断剂(H7)和PKA信号通路阻断剂(H89)预处理均可抑制CGRP对IL-4的促进效应(P0.05)。 结论： 1.LPS诱导的ALI小鼠肺内CGRP mRNA表达增加。 2. CGRP可促进IL-4诱导的小鼠巨噬细胞替代激活,其胞内信号转导机制可能与钙调蛋白、PKC和PKA信号通路有关。
【关键词】：急性肺损伤 降钙素基因相关肽 替代激活 巨噬细胞
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 1 前言14-16
• 2 材料与方法16-25
• 2.1 实验材料16-17
• 2.1.1 实验动物16
• 2.1.2 细胞16
• 2.1.3 试剂16-17
• 2.1.4 主要仪器设备17
• 2.2 实验方法17-25
• 2.2.1 常用溶液及缓冲液配制17-18
• 2.2.2 小鼠ALI动物模型的复制18
• 2.2.3 肺组织HE染色18
• 2.2.4 肺组织总RNA的提取18-19
• 2.2.5 小鼠巨噬细胞的培养19
• 2.2.6 培养前器具处理19-20
• 2.2.7 细胞复苏20
• 2.2.8 细胞状态观察及活力检测20
• 2.2.9 细胞换液和传代20-21
• 2.2.10 细胞冻存21
• 2.2.11 细胞实验分组21
• 2.2.12 巨噬细胞替代激活模型的复制21
• 2.2.13 细胞总RNA提取21-22
• 2.2.14 逆转录22-23
• 2.2.15 聚合酶链式反应23-24
• 2.2.16 统计学分析24-25
• 3 结果25-32
• 3.1 ALI时小鼠肺内CGRP mRNA表达的变化25-26
• 3.1.1 小鼠ALI动物模型的验证25
• 3.1.2 ALI小鼠肺组织CGRP mRNA表达的变化25-26
• 3.2 LPS应激小鼠巨噬细胞CGRP mRNA表达的变化26-28
• 3.2.1 细胞培养及活力检测26-27
• 3.2.2 总RNA提取结果27
• 3.2.3 LPS应激下小鼠巨噬细胞CGRP mRNA表达的变化27-28
• 3.3 CGRP对小鼠巨噬细胞替代激活的影响及机制28-32
• 3.3.1 CGRP对静息状态小鼠巨噬细胞Arg-1 mRNA表达的影响28
• 3.3.2 CGRP对IL-4诱导的小鼠巨噬细胞Arg-1 mRNA表达的影响28-30
• 3.3.3 CGRP对IL-4诱导的小鼠巨噬细胞IL-10 mRNA表达的影响30
• 3.3.4 CGRP上调IL-4诱导小鼠巨噬细胞Arg-1 mRNA表达的胞内信号转导机制30-32
• 4 讨论32-36
• 5 结论36-37
• 参考文献37-43
• 综述43-63
• 参考文献55-63
• 攻读学位期间主要的研究成果63-64
• 致谢64

【共引文献】

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本文编号：635656