单细胞检测SKOV3细胞转染端粒酶逆转录酶基因的表达及在监测体外培养胚胎细胞中的应用

发布时间：2017-08-07 19:36

  本文关键词：单细胞检测SKOV3细胞转染端粒酶逆转录酶基因的表达及在监测体外培养胚胎细胞中的应用

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【摘要】：目的：构建携带人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)的慢病毒表达载体,检测hTERT基因在SKOV3细胞中的表达。方法：通过基因克隆构建携带目的基因hTERT的重组慢病毒表达载体LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT,酶切、DNA测序验证插入片段hTERT的准确性。慢病毒载体、包装系统共转染293T细胞,超速离心沉淀法浓缩病毒上清,有限稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒感染SKOV3细胞(SKOV3h),另外设立慢病毒空载体感染组(SKOV3b)和无处理组(SKOV3)为对照组,显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、PCR验证hTERT mRNA表达、Western blot验证hTERT蛋白表达。结果：重组慢病毒LV4-pGLV-EFla-EGFP-hTERT与包装质粒共转染293T细胞能产生重组病毒;目的基因hTERT能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞并稳定表达,荧光显微镜下可直接观察到GFP; PCR、Western blot检测感染后的SKOV3细胞,发现hTERT基因mRNA、蛋白表达均增强。结论：成功构建了慢病毒表达载体LV4-pGLV-EFla-EGFP-hTERT,其能将外源hTERT基因导入SKOV3细胞并使其长久表达,为永生化研究奠定了科研基础。 目的：初步建立单细胞PCR检测基因表达的方法,探讨通过该方法检测SKOV3细胞和体外培养胚胎细胞hTERT基因mRNA的表达。方法：1.通过细胞数目、模板、引物等条件优化建立最佳的单细胞PCR检测基因表达的方法。2.实验分为三组,即通过慢病毒转染稳定高表达hTERT蛋白的细胞株(SKOV3h),空载体感染组(SKOV3b)和未处理组(SKOV3),通过优化的方法PCR检测三组细胞hTERT基因mRNA的表达。3.实时PCR检测单个卵裂球hTERT基因的表达。结果：初步摸索的细胞数在50个以内,且随着细胞数目的增多Ct (Cycle threshold)值逐渐增大(P0.05),最佳细胞数目为5个；模板3μL,引物0.2μL时PCR所得结果最佳；按最佳单细胞PCR条件测得SKOV3h组hTERT基因mRNA表达最高,SKOV3b组次之,SKOV3组表达最低(P0.05)；单个卵裂球可以有效检测到hTERT基因mRNA表达。结论：SKOV3细胞转导hTERT基因后可促进该基因的mRNA表达,提示单细胞检测基因表达有一定的灵敏度；单卵裂球检测到基因表达为利用单细胞单基因遗传学诊断及肿瘤学研究提供基础。 单细胞PCR出现于上世纪80年代后期,开创了单细胞基因表达的先河,它为在生命的基本单位——单细胞水平上进行产前诊断、基因表达与DNA测序等领域的研究提供了简便又快捷的方法。二十多年来,该技术不断改进,从最初的神经生物学研究发展到免疫研究、胚胎移植等领域。随着时代的进步,单细胞PCR在生命科学研究中将发挥更大的作用。
【关键词】：基因克隆 慢病毒 hTERT 端粒酶 单细胞 PCR hTERT 流式细胞术 单细胞 RT-PCR 应用
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 英文缩略词6-8
• 摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 第一章 慢病毒转染检测端粒酶逆转录酶基因hTERT在SKOV3中的表达17-73
• 1. 材料18-24
• 1.1 质粒、菌株、细胞18-19
• 1.2 主要设备及仪器19-20
• 1.3 主要试剂20-21
• 1.4 主要试剂配制21-23
• 1.5 引物设计23-24
• 2. 方法24-45
• 2.1 pGLV-EF1a-EGFP-hTERT慢病毒表达载体的构建24-29
• 2.2 携带hTERT基因重组慢病毒的包装、浓缩、感染29-34
• 2.3 重组慢病毒pGLV-EF1a-EGFP-hTERT在靶细胞中的表达34-44
• 2.4 统计学处理44-45
• 3. 结果45-65
• 3.1 重组慢病毒质粒pGLV-EF1a-EGFP-hTERT的鉴定45-60
• 3.2 包装细胞293T转导pGLV-EF1a-EGFP-hTERT后GFP的表达60
• 3.3 病毒滴度测定60-61
• 3.4 重组慢病毒pGLV-EF1a-EGFP-hTERT感染卵巢癌SKOV3细胞后GFP的表达61-62
• 3.5 重组慢病毒转导细胞前后端粒酶基因hTERTmRNA的表达62-63
• 3.6 BCA法测定蛋白浓度63
• 3.7 重组慢病毒感染SKOV3细胞后hTERT蛋白表达情况63-65
• 4. 讨论65-70
• 参考文献70-73
• 第二章 单细胞PCR检测细胞中端粒酶hTERT基因表达方法的建立73-91
• 1. 材料74-76
• 1.1 细胞来源74
• 1.2 试剂与仪器74-76
• 1.3 引物设计与合成76
• 2. 方法76-81
• 2.1 细胞培养76-77
• 2.2 单细胞PCR77-80
• 2.3 单卵裂球实时PCR80-81
• 2.4 统计学处理81
• 3. 结果81-86
• 3.1 细胞数目的确定81-82
• 3.2 引物与cDNA含量的确定82-83
• 3.3 两步法所得结果83-84
• 3.4 一步法所得结果84
• 3.5 hTERT基因mRNA表达分析84-85
• 3.6 单卵裂球PCR体系优化85-86
• 3.7 单卵裂球PCR结果86
• 4. 讨论86-89
• 参考文献89-91
• 综述 单细胞RT-PCR技术应用进展91-110
• 1. 单细胞RT-PCR技术研究特点91-98
• 1.1 单细胞的获得93-95
• 1.2 单细胞的裂解95-96
• 1.3 单细胞RT-PCR扩增96-98
• 2. 单细胞RT-PCR技术的应用98-102
• 2.1 在基因表达方面的应用98-99
• 2.2 在植入前基因诊断方面的应用99-101
• 2.3 在离子通道及受体方面的应用101-102
• 3. 单细胞RT-PCR的未来发展前景102-104
• 参考文献104-110
• 致谢110-112
• 攻读学位期间参与的课题及发表的学术论文112

【参考文献】

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本文编号：636373