100株中国HBV全长基因序列的克隆及分析

发布时间：2017-08-07 21:11

  本文关键词：100株中国HBV全长基因序列的克隆及分析

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【摘要】：[目的]：不同基因型的HBV可能有不同的生物学特性,病毒基因型可能与长期感染的病程进展及对干扰素的治疗反应有关。目前我国HBV全长序列较少,本研究通过建立一种高效快速的HBV全基因组克隆方法,进行病毒基因序列测定并获取一定数量的HBV全长序列基因,为实现HBV结构和功能蛋白特异性原核表达做准备,利用序列分析软件对得到的序列进行基本的型别分析,分析不同基因型之间的区别及联系,从而丰富我国的HBV全长基因库,为HBV基因特点与HBV变异研究、HBV药物及疫苗研究以及乙型肝炎的个体化治疗提供参考依据。 [方法]：收集100份HBV-DNA阳性的慢性HBV感染者血清标本,提取HBV全基因组,从Genbank中下载100条HBV全长序列作为引物设计参考,设计合适的特异性引物进行扩增,用一步法聚合酶链式反应(PCR)得至HBV PCR产物,与合适的载体进行快速连接,通过蓝白斑筛选挑出正确的单克隆进行测序得到HBV全长序列,利用序列分析软件对所得到的全长序列进行基本的分析。 [结果]：建立了一种区别于传统TA克隆的连接方法,利用两对引物可直接将HBV全长序列(插入片段)与pMD18T(T载体)进行连接,提高了连接效率与成功率；从乙型肝炎患者血清中提取了HBV基因组DNA,经PCR扩增得到预期大小的全长基因；构建重组pMD18T-HBV载体,经酶切证实具有与日标片段长度相符的插入片段：在已经向NCBI提交的51株HBV全长序列,测序结果分析显示,B基因型18例(35.29%),C基因型33例(64.70%),没有B+C型,发现YMDD耐药株3例。 [结论]：利用高效的克隆连接方法,可以大大简化插入片段与载体的连接步骤,提高效率与成功率。克隆了HBV DNA中国株的全基因序列,可以作为研究中HBV流行株的参考序列。对完成克隆的51株HBV全长序列分析,发现全部为B型与C型,未发现其他基因型。由于样本量较小,且人口流动性较大,无法对地域方面的流行病学特征做进一步的分析。
【关键词】：肝炎病毒 乙型 HBV全基冈组克隆 聚合酶链式反应
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.21;R3416
【目录】：

• 英文缩略词5-6
• 中文摘要6-7
• ABSTRACT7-8
• 前言8-11
• 材料与方法11-13
• 1. 材料11-12
• 2. 方法12-13
• 结果13-27
• 1. HBV全基因组序列引物的设计13-14
• 2. 新型载体连接方法的建立14-16
• 3. 质粒的构建16-20
• 4. 序列分析结果20-27
• 讨论27-30
• 结论30-31
• 参考文献31-35
• 附录35-67
• 攻读学位期间发表文章情况67-68
• 致谢68

【参考文献】

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1 边涛;沈立萍;王峰;王岳;张丽文;张勇;毕胜利;;一株重组乙型肝炎病毒的全基因克隆和序列分析[J];病毒学报;2008年04期

2 徐烟青,周永东,毕胜利;我国藏族居民乙型肝炎病毒基因型的初步研究[J];中华实验和临床病毒学杂志;2005年02期

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本文编号：636716