一个TetR家族转录因子Rv3066的调控功能分析及其对细菌耐药性的影响

发布时间：2017-08-08 06:22

  本文关键词：一个TetR家族转录因子Rv3066的调控功能分析及其对细菌耐药性的影响

  更多相关文章： 结核分枝杆菌 Rv3066 药物外排泵 耐药性

【摘要】：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,以下简称M. tuberculosis)是最具破坏性的人类病原菌之一,随着耐多药结核病(Multidrug-resistant tuberculosis,以下简称MDR-TB)的出现以及与HIV共感染在全世界范围的广泛流行,该病原菌对人类的健康产生了严重威胁。因此,研究M. tuberculosis的耐药性显得尤为迫切。Mmr(由 rv3065所编码)是M. tuberculosis中唯一一个属于SMR家族的药物外排泵,能识别并能有效排出大量抗菌剂,促使M. tuberculosis对这些抗菌剂产生内在抗药性。然而目前对Mmr的体内调控机制还研究得不清楚。巧合的是,TetR家族转录因子Rv3066与mmr基因处于同一个操纵子,推测Rv3066可能调控mmr的表达,进而影响M. tuberculosis的耐药性。因此本课题开展了Rv3066的功能分析及其对细菌耐药性的研究,研究结果如下：(1)采用细菌单杂交实验和凝胶迁移率(EMSA)实验证明了转录因子Rv3066与mmrp存在相互作用；(2)利用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验证明了Rv3066与mmrp在体内也存在相互作用；(3)通过EMSA实验发现转录因子Rv3066与mmrp结合模体可能位于其S2小片段中,进一步通过竞争实验证明转录因子Rv3066与S2片段的结合是特异的；(4)采用DNA酶足迹法(I)NaseI footprinting),鉴定出了转录因子Rv3066与 mmrp的结合模体；(5)采用p-半乳糖苷酶活性实验和实时定量PCR (qRT-PCR)实验证明了Rv3066为转录抑制子,抑制mmr基因的表达；(6)在Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin(以下简称M. bovis BCG)中将rv3066的同源基因bcg_3091敲除之后,该菌株生长速率变慢,对Mmr外排泵底物吖啶黄、溴化乙锭(以下简称EB)产生抗性。综上所述,我们推测转录因子Rv3066为转录抑制子,在体内通过影响mmr基因的表达,进而影响M. tuberculosis对药物产生抗性。
【关键词】：结核分枝杆菌 Rv3066 药物外排泵 耐药性
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 中文摘要6-7
• ABSTRACT7-9
• 缩略语表9-11
• 1 前言11-23
• 1.1 结核分枝杆菌耐药分子机制11-18
• 1.1.1 耐一线抗结核药物的分子机制12-14
• 1.1.2 药物外排泵14-18
• 1.2 药物外排泵与基因调控18
• 1.3 Mmr外排泵研究现状18-19
• 1.4 TetR家族转录因子概况19-20
• 1.5 转录因子Rv3066研究现状20-21
• 1.6 课题研究的目的与意义21-22
• 1.7 课题研究主要内容22-23
• 2 实验材料和方法23-39
• 2.1 实验材料23-27
• 2.1.1 培养基23
• 2.1.2 酶和抗生素23-24
• 2.1.3 菌株24-25
• 2.1.4 质粒25-26
• 2.1.5 引物26-27
• 2.2 实验方法27-39
• 2.2.1 分子生物学基本操作27
• 2.2.2 细菌单杂交27-28
• 2.2.3 M.bovis BCG感受态细胞的制备28
• 2.2.4 电转化28-29
• 2.2.5 质粒提取29
• 2.2.6 蛋白质表达纯化及透析29-30
• 2.2.7 抗血清制备30
• 2.2.8 凝胶迁移率实验30-31
• 2.2.9 DNA酶足迹实验(DNaseI footprinting)31-32
• 2.2.10 敲除菌株的获得32-33
• 2.2.11 Southern Blot33-35
• 2.2.12 染色质免疫共沉淀(ChIP)35-36
• 2.2.13 实时定量PCR(qRT-PCR)36-38
• 2.2.14 β-半乳糖苷酶活性测定38
• 2.2.15 生长曲线测定38-39
• 3 结果与分析39-60
• 3.1 细菌单杂交实验证明Rv3066与mmrp存在潜在的物理相互作用39-42
• 3.1.1 rv3066基因片段及mmrp片段的获得39-40
• 3.1.2 pBX-mmrp及pTRG-Rv3066质粒的构建40-41
• 3.1.3 细菌单杂交实验证实Rv3066与mmrp存在相互作用41-42
• 3.2 EMSA实验证实转录因子Rv3066与mmrp存在相互作用42-44
• 3.2.1 表达载体的构建及蛋白质表达纯化42-44
• 3.2.2 EMSA实验证实转录因子Rv3066与mmrp存在相互作用44
• 3.3 染色质免疫共沉淀实验证实Rv3066与mmrp在体内也存在相互作用44-46
• 3.4 启动子截短后EMSA实验进一步锁定结合位点46-48
• 3.5 DNA酶足迹实验鉴定结合模体48-50
• 3.5.1 DNA酶足迹实验48-49
• 3.5.2 保守位点缺失后的EMSA实验49-50
• 3.6 pMind-BCG3091敲除载体的构建及BCG/BCG3091::hyg菌株的获得50-56
• 3.6.1 pMind-BCG3091敲除载体的构建50-52
• 3.6.2 BCG/BCG3091：：hyg敲除菌株获得52-54
• 3.6.3 Southern Blot证实bcg_3091已被成功敲除54-56
• 3.7 转录因子Rv3066为转录抑制子56-58
• 3.7.1 β-半乳糖苷酶实验证实Rv3066对mmrp起阻遏调节作用56-57
• 3.7.2 qRT-PCR实验证实Rv3066抑制mmr基因的表达57-58
• 3.8 药物敏感性实验证明Rv3066的调控与M.tuberculosis抗药性有关58-60
• 4 总结与讨论60-63
• 4.1 总结60
• 4.2 讨论60-63
• 参考文献63-73
• 致谢73

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