金黄色葡萄球菌的分子特征分析及其对莫匹罗星的耐药机制研究

发布时间：2017-08-08 09:34

  本文关键词：金黄色葡萄球菌的分子特征分析及其对莫匹罗星的耐药机制研究

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【摘要】：研究背景 金黄色葡萄球菌是一种非常普遍的人类病原微生物,可以引起多种感染性疾病,包括：皮肤软组织感染、心内膜炎、骨髓炎、菌血症和致死性肺炎等。临床上从不同感染组织分离的金黄色葡萄球菌在流行病学上具有多态性的特点,可以分为不同的克隆株。不同的克隆株其耐药基因以及毒力因子的携带情况是否具有差别,以及金黄色葡萄球菌的表型和分子特征是否具有相关性等。对金黄色葡萄球菌的分子特征分析可以帮助我们解决这些问题,从而为设计有效的预防和感染措施来对抗金黄色葡萄球菌引起的医院感染提供依据,监控物种进化的过程,并为后续的机制研究提供资料。 金黄色葡萄球菌的分子特征分析结果显示其对莫匹罗星的耐药基因mupA的阳性率较高。在临床上莫匹罗星主要用于清除医护人员和医院住院患者金黄色葡萄球菌引起的鼻腔定植。医院住院患者金黄色葡萄球菌的鼻腔定植会大大增加院内金黄色葡萄球菌血液感染、透析相关感染及手术部位感染的风险。因此对莫匹罗星耐药率的监测及耐药机制的研究意义重大。 第一部分金黄色葡萄球菌的分子特征分析 目的：分析上海华山医院2005到2010年分离自病人不同感染组织的金黄色葡萄球菌的克隆分型特点,包括其随时间的变化趋势及表型与克隆型的联系,不同克隆株耐药和毒力基因携带情况及其与克隆分型之间的联系。方法：收集上海华山医院2005年到2010年从病人不同感染组织中分离鉴定的金黄色葡萄球菌610株,运用药敏纸片法对所有的菌株进行药物敏感实验；按照国际通用的多位点保守基因序列分型(MLST)以及葡萄球菌A蛋白(spa)序列分析方法进行克隆株的鉴定分析；用多重PCR方法对所有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株进行SCCmec分型；采用PCR方法对其中108株细菌的耐药以及毒力基因携带情况进行分析。结果：610株金黄色葡萄球菌的克隆分型结果显示：共鉴定出20种STs(主要克隆型是：ST239,ST5,ST7,ST188和ST398)和52种spa型(流行株是t002,t037,t030和t601)。共分离出444株MRSA(72.8%)和116株(27.2%)甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA). ST239-MRSA-Ⅲ-spa t037和t002是MRSA菌株的两株流行株。2005到2010年,spa t002和spa t037和他们相应的STs(ST5和ST239)是610株金黄色葡萄球菌的流行克隆型,并且对多种抗生素表型耐药。不同克隆型的耐药率不同,但并未检测出对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药的菌株。不同毒力和耐药基因在不同克隆株的分布不同。ST239和ST5对庆大霉素、头孢西丁、青霉素、头孢唑林、红霉素、克林霉素和左氧氟沙星的耐药率普遍高于其他克隆型,耐消毒剂基因qacA/B在这两种克隆型中的阳性率最高。不同感染组织中ST型的分布是不同的,并随时间而变化。近两年来(2009和2010年),MRSA菌株的比例下降,以非流行株为主(除ST5和ST239)的MSSA菌株的比例升高,尤其是在血液中。结论：金黄色葡萄球菌的表型及毒力和耐药基因的分布与克隆分型有相关性。近两年来,以非流行株为主的MSSA菌株的分离率明显增加,尤其是在血液中。对临床金黄色葡萄球菌的持续监测可为金黄色葡萄球菌的院内感染控制提供客观依据。 第二部分金黄色葡萄球菌对莫匹罗星的耐药表型特征和耐药机制研究 目的：分析自上海华山医院、山东省立医院、温州医学院第一附院和温州社区分离的金黄色葡萄球菌对莫匹罗星的耐药表型特征及耐药机制。方法：收集了796株金黄色葡萄球菌,其中上海华山医院270株,山东省立医院185株,温州医学院第一附院241,温州社区100株。采用琼脂平板筛选法筛选耐药菌株,并用微量标准肉汤稀释法对筛选出来的耐药菌株进行确认。用PCR方法对其中627株细菌mupA基因携带情况进行分析。选取了17株高水平耐药菌株、9株低水平耐药菌株和13株敏感菌株,扩增ileS基因并测序,而后与已发表的金黄色葡萄球菌的ileS基因的标准序列进行对比。选取了5株高水平耐药菌株抽取质粒。质粒电泳后转到尼龙膜上,并以地高辛标记的mupA基因为探针进行杂交。并将这5株菌的质粒电转至受体菌金黄色葡萄球菌RN4220后,筛选出对莫匹罗星高水平耐药的RN4220菌株。抽取高水平耐药的RN4220菌株的质粒。质粒电泳后转到尼龙膜上,并以地高辛标记的mupA基因为探针进行Southern blotting。结果：共筛选出40株耐药菌株,31株高水平耐药株,9株低水平耐药株。华山医院、省立医院和温州附院莫匹罗星耐药率分别为：9.6%(26/270)、4.9%(9/185)和2.1%(5/241)。温州社区100株细菌中没有对莫匹罗星耐药菌株。华山医院2004、2007和2010年莫匹罗星耐药率分别为：12.8%(12/94),9.6%(8/83),6.5%(6/93),呈下降趋势。与微量标准肉汤稀释法相比,用PCR方法扩增mupA基因来检测金黄色葡萄球菌是否对莫匹罗星高水平耐药,灵敏度可达100%,特异度是98.7%。与低水平耐药密切相关的是ileS基因第1762位碱基G到T的突变(G1762T)。高水平耐药株质粒转膜后的Southern blotting结果显示mupA基因的杂交部位在54kb左右的质粒上。高水平耐药菌株RN4220质粒转膜后的Southern blotting结果显示mupA基因的杂交部位在54kb左右的质粒上。结论：华山医院中金黄色葡萄球菌对莫匹罗星的耐药率高于山东省立医院和温州第一附院,并呈下降趋势。温州社区未检测到对莫匹罗星耐药金黄色葡萄球菌。与低水平耐药密切相关的是ileS基因(G1762T)的变化。金黄色葡萄球菌的高水平耐药与获得含有mupA基因的54kb左右的质粒相关。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 克隆分型 耐药 毒力基因 金黄色葡萄球菌 莫匹罗星 耐药 mupA
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：

• 英文缩略词表4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-15
• 第一部分：金黄色葡萄球菌的分子特征分析15-35
• 引言15
• 材料与方法15-22
• 结果22-31
• 讨论31-35
• 第二部分：金黄色葡萄球菌对莫匹罗星的耐药表型特征和耐药机制研究35-52
• 引言35-36
• 材料与方法36-43
• 结果43-49
• 讨论49-52
• 总结52-53
• 1、05到，
  
  本文编号：639326
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