隐孢子虫CypA蛋白对单核巨噬细胞系THP-1细胞的免疫调控作用研究

发布时间：2017-08-08 20:08

  本文关键词：隐孢子虫CypA蛋白对单核巨噬细胞系THP-1细胞的免疫调控作用研究

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【摘要】：研究目的： 隐孢子虫亲环素（Cyclophilin，CypA）是否为分泌性蛋白，对免疫细胞具有功能调控作用尚不清楚，研究隐孢子虫CypA对巨噬细胞的功能调控作用，筛选对巨噬细胞具有调控作用的CypA来源的多肽，并揭示其调控作用的信号通路机制。基于隐孢子虫感染人体后的第一道防线是固有免疫，巨噬细胞是固有免疫中的重要细胞，研究隐孢子虫分泌的CypA对巨噬细胞的功能的影响对于理解隐孢子虫的免疫逃逸和机会致病性具有一定意义。 研究方法： 1、隐孢子虫CypA蛋白为分泌性蛋白的确定 利用本实验室前期构建的pGEX-4T-1-CypA全长及pGEX-4T-1-CypA-30质粒中的目的基因片段CypA全长及CypA-30，设计真核表达载体pcDNA3.1+的相关引物，PCR扩增CypA全长及CypA-30基因片段，亚克隆CypA-pcDNA3.1~+全长、CypA-30-pcDNA3.1~+及pcDNA3.1~+真核表达质粒。通过双酶切跑DNA电泳及测序鉴定为正确的重组载体后，将上述三种质粒转化E.coliDH5α，菌落PCR以大量扩增目的基因，再通过质粒抽提试剂盒抽提质粒，将上述三种正确质粒转染入Hela细胞，收集上清及细胞，Westernblot检测CypA的分泌情况。 2、隐孢子虫CypA蛋白和其来源多肽对THP-1细胞功能的调控 将上述真核重组CypA质粒转染入THP-1细胞，cck-8检测CypA对THP-1细胞增殖的影响。根据生物信息学分析，设计并合成CypA来源的α、β、γ三段多肽，应用不同浓度组的多肽刺激THP-1细胞，筛选出对THP-1细胞具有调控作用的多肽浓度；应用该浓度多肽作用THP-1细胞，cck-8检测细胞增殖作用；流式细胞仪检测其对THP-1细胞周期及凋亡的影响；ELISA法测定THP-1细胞中IL-8及TNF-α细胞因子的分泌情况；Westernblot检测CypA来源多肽对THP-1细胞信号通道的影响。 研究结果： 1、隐孢子虫CypA蛋白为分泌性蛋白的实验证实 成功扩增CypA全长及CypA-30基因片段，双酶切及跑DNA电泳鉴定为正确的重组质粒，测序结果也证实是正确的重组质粒。CypA-pcDNA3.1~+全长、CypA-30-pcDNA3.1~+及pcDNA3.1~+转染入Hela细胞后，收集细胞上清及细胞，通过Westernblot发现CypA-pcDNA3.1~+全长组上清及细胞中都能检测到CypA蛋白；CypA-30-pcDNA3.1~+组细胞中能检测到CypA蛋白，而上清中没有；pcDNA3.1~+组上清及细胞中都没有CypA蛋白，说明CypA是分泌性蛋白。 2、CypA来源多肽的合成及其对THP-1细胞功能的调控及细胞信号通道的影响 上述三种质粒转染入THP-1细胞，cck-8检测CypA对THP-1细胞增殖没有促进作用。应用CypA来源的不同浓度组的α、β、γ三段多肽刺激THP-1细胞，发现β多肽对THP-1细胞增殖有促进作用；流式细胞仪检测β多肽对THP-1细胞周期及凋亡的影响无统计学意义；Westernblot检测CypA来源β多肽对THP-1细胞ERK1/2及JNK表达与磷酸化产生影响；ELISA法测定THP-1细胞中IL-8及TNF细胞因子的分泌在统计学上没有差异。 结论： 成功构建CypA-pcDNA3.1~+全长、CypA-30-pcDNA3.1~+重组质粒，确定了CypA是一个分泌性蛋白，为我们研究CypA对细胞功能的调控奠定了基础。CypA来源的β多肽对THP-1细胞增殖有促进作用，并且对THP-1细胞ERK1/2及JNK表达与磷酸化产生影响，，很有可能CypA来源的β多肽是通过ERK1/2及/或JNK细胞信号通道来调控THP-1细胞的增殖作用。
【关键词】：隐孢子虫 CypA β多肽 THP-1细胞
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.3
【目录】：

• 中文摘要3-7
• Abstract7-12
• 前言12-17
• 1.1 CypA与寄生虫13
• 1.2 CypA参与炎症反应13-14
• 1.3 CypA与肿瘤的发生14-15
• 1.4 CypA与艾滋病的关系15-16
• 1.5 CypA与THP-1细胞16
• 1.6 研究目的、内容与意义16-17
• 2 实验技术路线17-19
• 2.1 第一部分技术路线17-18
• 2.2 第二部分技术路线18-19
• 3 材料和方法19-35
• 3.1 实验材料和试剂19-20
• 3.2 实验仪器和设备20-22
• 3.3 实验方法22-24
• 3.4 实验步骤24-35
• 4 实验结果35-49
• 5 讨论49-54
• 6 结论54-55
• 参考文献55-66
• 附录一 中英文缩略词表66-68
• 附录二 在校期间论文发表的情况68-69
• 附录三 本研究基金资助69-70
• 致谢70

【参考文献】

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本文编号：641788