不同急性肝损伤模型大鼠卵圆细胞生物学差异及自噬的变化

发布时间：2017-08-09 02:13

  本文关键词：不同急性肝损伤模型大鼠卵圆细胞生物学差异及自噬的变化

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【摘要】：多种原因均可引起急性肝损伤的发生，急性肝损伤后的高死亡率和预后差一直是医学界的难题。目前如何更好地治疗肝损伤仍是国内外的一个难点。严重的急性肝功能损伤常引起急性肝功能衰竭，致肝功能不可逆转而危及生命。终末期肝病目前最好的治疗方法为原位肝移植，但供体有限及术后免疫排斥反应是两个主要的障碍。 卵圆细胞作为肝脏的干细胞，在肝损伤的修复中发挥重要作用。研究发现，卵圆细胞不同时间点其增殖率不同，于此提出卵圆细胞在各时间点增殖动力存在差异，EpCAM和PCNA共表达反应卵圆细胞增殖活性，即各时间点EpCAM和PCNA共表达存在差异。卵圆细胞具有多向分化功能，其可分化为肝细胞、胆管细胞及肝癌细胞，甚至胰岛细胞等，而在对卵圆细胞标记物的研究中发现胆管细胞表达CK19，肝母细胞表达AFP，可进行卵圆细胞分化方向的判断。判断卵圆细胞的分化研究有助于对肝脏疾病治疗进行评估。 近年，自噬与凋亡的研究是热点问题。自噬是一个必不可少的，保守的通过消除蛋白质聚集和破坏细胞器来控制胞浆性质的溶酶体降解过程。自噬与凋亡存在密切关系，两者相互协同而对细胞转归产生影响。而自噬与凋亡的确切关系仍存在争议。卵圆细胞作为肝脏干细胞，参与肝脏的再生性修复及疾病演变，卵圆细胞是否存在自噬现象与其分化与增殖有无关联？本实验建立了不同的急性肝损伤模型，对卵圆细胞在不同情况下增殖及分化有无差异，并对肝损伤修复中自噬及凋亡进行了初步研究。 目的：建立不同的肝卵圆细胞增殖模型，观察其增殖、分化的差异及自噬的变化情况。 方法：①选择健康SD大鼠随机分为五组，分别为四氯化碳组、D-gal组、假手术组、2-AAF/PH组及空白对照组，建立肝损伤模型。分别于1d、7d、14d、21d处死动物取肝脏组织。②采用hematoxylin＆eosin staining (H＆E染色)观察大鼠肝组织病理组织学表现。③免疫荧光技术观察不同时间点卵圆细胞表达，对阳性细胞进行定量技术分析。④免疫荧光双标方法观察卵圆细胞增殖动力变化。⑤免疫组织化学方法观察卵圆细胞分化标记物AFP、CK-19、C-kit的表达，并对其进行定量技术分析判断其表达有无差异。⑥电镜下观察卵圆细胞自噬体超微结构。⑦Western Blotting技术观察自噬标记蛋白LC3-II蛋白及Beclin-1蛋白表达。⑧原位缺口末端标记法（TUNEL）检测凋亡有无变化。 结果：①与空白对照组相比，应用四氯化碳组大鼠肝脏颜色为暗红色，质脆，约14天后渐恢复正常；D-gal组大鼠肝脏水肿明显，色暗红，质脆，约14天后渐恢复正常；假手术组大鼠肝脏与之相比未见明显差异；2-AAF/PH组与之相比，1天肝脏呈淡红色，质脆，约21天后肝脏大小及颜色恢复正常。②肝脏组织H＆E结果显示，与空白对照组相比，四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组可见肝细胞肿胀，排列紊乱，于汇管区周围可见细胞形态小于肝细胞，核质深染，细胞核呈卵圆形的卵圆细胞；四氯化碳组和D-gal组炎症细胞浸润明显比2-AAF/PH组少，卵圆细胞少。③血清肝功能检测显示，大鼠造模完成后第1天肝功能同空白对照组相比，假手术组肝功能变化无明显差异。四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组大鼠天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotrans ferase, ALT）及碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）水平明显升高（AST：133.97±14.35U/L vs82.47±21.86U/L, P 0.05;346.17±9.75U/L vs82.47±21.86U/L, P 0.05;557.97±12.85U/L vs82.47±21.86U/L, P 0.05; ALT:47±9.35U/L vs41.97±6.64U/L, P0.05；102.44±5.04U/L vs41.97±6.64U/L, P 0.05；249.1±19.71U/L vs41.97±6.64U/L, P 0.05；ALP：270.33±36.09U vs53.27±8.50U，P 0.05；379.33±21.55U vs53.27±8.50U，P 0.05；520.67±33.02U vs53.27±8.50U，P 0.05；），白蛋白(albumin，ALB)水平明显下降（23.37±2.21g/L vs32.13±3.73g/L, P 0.05；22.9±2.50g/L vs32.13±3.73g/L, P 0.05；23.9±1.06g/L vs32.13±3.73g/L, P 0.05）。四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组之间比较，2-AAF/PH组肝功能变化较大。④免疫荧光检测小鼠抗大鼠OV6抗体表达显示：四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组对OV6抗体表达均在1～14天表达呈上升趋势，14～21天呈下降趋势，14天表达量最高。假手术组与空白对照组比较表达无明显规律性。四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组与空白对照组相比OV6抗体的表达在术后1天、7天、14天及21天均明显增高，尤以14天升高最明显（109.67±4.04vs5.67±1.53，P 0.05；154.67±8.02vs5.67±1.53，P 0.05；292.67±8.50vs5.67±1.53，P 0.05），假手术组表达无明显变化（2.67±0.58vs5.67±1.53，P0.05）。四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组之间相比，2-AAF/PH组对OV6抗体的表达明显增高。⑤EpCAM和PCNA荧光双标检测反映卵圆细胞增殖动力：四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组卵圆细胞增殖率在术后1天、7天、14天及21天呈下降趋势，并在术后7~14天下降明显，2-AAF/PH组在7天时为（82.8±2.60）%，在14天则下降至（51.90±2.01）%，P 0.05有统计学意义。假手术组与空白对照组比较无明显差异。⑥免疫组织化学染色显示：与空白对照组相比，四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组对AFP、CK19及C-kit的表达均增加，且为1~14天呈上升趋势，14天达高峰值，14~21天呈下降趋势（AFP、CK19及C-kit四氯化碳组：116.67±3.51vs4.33±2.31，P 0.05；108.67±6.51vs2.67±0.89，P 0.05；105.33±4.16vs4.00±1.00，P 0.05； D-gal组：155.33±5.69vs4.33±2.31，P 0.05；148.67±6.03vs2.67±0.89，P 0.05；157.67±3.22vs7.67±2.08，P 0.05；2-AAF/PH组:265.33±8.08vs4.33±2.31，P 0.05；261.0±18.68vs2.67±0.89，P 0.05；236.33±6.51vs4.00±1.00，P 0.05）。假手术组与空白对照组比较无明显变化（4.67±1.15vs4.33±2.31，P0.05；3.00±1.00vs2.67±0.89，P0.05；3.67±0.58vs4.00±1.00，P0.05）。四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组对AFP的表达存在差异（F值为260.421，P 0.01）；对CK19的表达有差异（F值为144.632，P 0.05）；对C-kit的表达有差异（F值为273.875，P 0.05）,表现为2-AAF/PH组对AFP、CK19及C-kit的表达高于其余各组。⑦透射电镜显示1天、7天、14天及21天卵圆细胞内均未发现自噬体。1天时电镜下观察卵圆细胞体积小，胞核与胞浆比值较高，细胞器组成为散在明显的微丝束和较多的核糖体及少许粗面内质网，7天到21天观察卵圆细胞体积多较1天时大，此时含有较多的粗面内质网及糖元，也可见少量的张力微丝。⑧Western blot检测结果显示：四氯化碳组、D-gal组及2-AAF/PH组大鼠肝脏组织中Beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白随时间变化表达水平明显增加，各组间对Beclin-1蛋白的表达存在差异（F值为7.811，P 0.05），各组间对LC3-Ⅱ蛋白的表达亦存在差异（F值为27.592，P 0.05）。假手术组与空白对照组大鼠肝组织Beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白表达水平与时间变化无明显变化（Beclin-1:F值为0.413，，P＞0.05; LC3-Ⅱ:F值为1.173，P＞0.05）。⑨TUNEL检测结果显示：2-AAF/PH组凋亡细胞表达在1~14天呈上升趋势，14~21天凋亡细胞表达呈下降趋势。 结论：不同模型的急性肝损伤肝脏的损伤程度不同,以2-AAF/PH组为重，四氯化碳组和D-gal组次之。2-AAF/PH组肝脏的修复通过肝卵圆细胞的活化来完成。四氯化碳组和D-gal组作为中等程度的肝损伤，其修复主要通过肝细胞的再生及少量卵圆细胞的活化来完成；2-AAF/PH模型卵圆细胞增殖活化数量多于其他模型，卵圆细胞增殖的高峰出现于术后7~14天；卵圆细胞增殖动力在卵圆细胞数达高峰前开始下降；不同卵圆细胞处于不同的分化阶段，在不同时间卵圆细胞处于不同的分化阶段；自噬增强可能促进肝损伤的修复的完成；自噬可能抑制肝损伤大鼠肝细胞的凋亡。
【关键词】：模型 肝卵圆细胞 增殖 分化 凋亡 自噬
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R575
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-14
• 材料与方法14-25
• 结果25-30
• 附图30-43
• 附表43-44
• 讨论44-48
• 结论48-49
• 参考文献49-52
• 综述 肝卵圆细胞生物学特性与肝癌的关系52-67
• 参考文献60-67
• 致谢67-68
• 个人简历68

【参考文献】

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1 徐树莹;乔录新;张玉林;陈德喜;;自噬功能研究进展[J];临床荟萃;2012年13期

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3 马俊勋,方驰华,张伟,朱新勇;成体大鼠肝干细胞分离、培养及形态学观察[J];中华肝胆外科杂志;2005年01期

4 Mekala Subba Rao;Aleem Ahmed Khan;Nyamath Parveen;Mohammed Aejaz Habeeb;Chittoor Mohammed Habibullah;Gopal Pande;;Characterization of hepatic progenitors from human fetal liver during second trimester[J];World Journal of Gastroenterology;2008年37期

本文编号：643070