大肠埃希菌多重耐药外排泵AcrAB-TolC主动外排机制的研究

发布时间：2017-08-09 15:23

  本文关键词：大肠埃希菌多重耐药外排泵AcrAB-TolC主动外排机制的研究

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【摘要】：研究目的：大肠埃希菌是当今社区感染及院内感染最常见的病原菌之一,是威胁人类健康的重要致病菌。随着抗生素在临床上的广泛应用及抗生素的升级换代,细菌对抗生素的耐药越来越严重。临床上多重耐药大肠埃希菌的出现和播散,严重影响了治疗效果,增加了治疗成本。对多重耐药大肠埃希菌的治疗是临床上非常重要的目标。细菌的耐药机制包括产生灭活酶、改变药物作用靶位、改变外膜通透性、主动外排作用,产生生物膜等。其中后三种机制是细菌产生多重耐药的最主要机制。阻止药物在菌体内聚集是细菌产生抗生素多重耐药的重要手段之一,由细菌的主动外排系统介导。大肠埃希菌的细胞外膜上存在多种外排系统可泵出多种结构无关的化合物,AcrAB-TolC外排泵是其中最主要的占绝对优势的多重药物外排泵,底物广泛,研究天津地区大肠埃希菌外排泵AcrAB-TolC在临床株中的携带情况、与耐药的相关性,及羰基氰氯苯腙(CCCP)对大肠埃希菌外排泵AcrAB-TolC的抑制作用,为临床多重耐药大肠埃希菌感染的防治探索可能的、新的思路。 研究方法： 1、菌株的收集、鉴定：收集2008年7月至2009年7月期间天津医科大学第二医院临床分离的大肠埃希菌90株,剔除同一病例相同部位重复菌株,所有菌株采用常规生化鉴定。大肠埃希菌标准菌株ATCC25922作为质量控制菌株,金黄色葡萄球菌ATCC25923为acra/acrb基因阴性对照菌株,这两种标准菌株均为天津市感染性疾病研究所保存菌株。 2、耐药模式分组：采用K-B纸片扩散法测定90株大肠埃希菌临床株对6种抗菌药物(氨曲南、头孢噻肟、左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星)的敏感性,药敏结果依据美国临床实验室标准化研究所(CLSI2011)判定标准,根据耐药模式分为多重耐药组、双药耐药组、单药耐药组、全敏感组。 3、外排泵基因acra/acrb基因的扩增：应用聚合酶链式反应(PCR)扩增90株临床分离的大肠埃希菌acra/acrb基因片段,PCR产物送北京华大科技有限公司进行正负双向DNA序列分析。 4、CCCP印制实验：选取10株多重耐药大肠埃希菌进行CCCP抑制实验,采取微量肉汤稀释法测定加泵抑制剂CCCP(终浓度为100umol/L)前后多重耐药菌株对5种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。 结果： 1、共收集大肠埃希菌90株,其中尿道分离菌37株,肠道分离菌36株,呼吸到分离菌5株,其它分泌物(血液、腹水等)分离菌株11株。 2、体外药物敏感实验结果：90株大肠埃希菌对6种抗菌药物均表现出不同程度的耐药,耐药率由高到低为环丙沙星67%,左氧氟沙星61%,庆大霉素53%,头孢噻肟50%,氨曲南20%,阿米卡星10%。耐药模式以双药耐药30株(33.3%),多重耐药26株(28.9%)为主,单药耐药22株(24.4%),全敏感12株(13.3%)。 3、acra/acrb基因PCR扩增及测序结果：90株临床分离的大肠埃希菌中55株(61.1%)均可见567bp (acra)及516bp (acrb)的扩增片段。金黄色葡萄球菌ATCC25923未见此扩增片段。选取大肠埃希菌临床株246acra基因扩增产物及临床株b716acrb基因扩增产物进行正负双向DNA序列分析,测序结果在GeneBank数据库中经行同源性对比后证实：临床株246, acra基因同源性为98%,临床株b716,acrb基因同源性为99%。其中多重耐药组22株acra阳性(84.6%),acrb21株阳性(80.8%)；双药耐药组acra16株阳性(53.3%),acrb17株阳性(56.7%)；单药耐药组acra12株阳性(54.5%),acrb13株阳性(59.1%)；全敏感组acra5株阳性(41.7%),acrb4株阳性(33.3%)。可见外排泵基因acra/acrb基因在4种耐药模式的大肠埃希菌临床株中普遍存在,在多重耐药组中阳性率最高,分别为84.6%和80.8%。对多重耐药组及全敏感组的acra基因及acrb基因阳性率进行统计学分析,采用x2检验,acra基因P=0.017；acrb基因P=0.009,结果具有统计学意义。 4、CCCP抑制实验结果：10株多重耐药的大肠埃希菌临床株在应用CCCP后,多数菌株对5种抗生素MIC均有不同程度的下降,能使绝大多数菌株恢复对抗生素的敏感性。菌株1034对头孢曲松的MIC最高下降倍数为128倍,菌株A620、C636、1034对5种抗生素均为耐药变为敏感。而菌株B1581和菌株O对5种抗生素的MIC基本没有改变。 结论： 1、90株大肠埃希菌临床株对6种抗生素均表现出不同程度的耐药,对氟喹诺酮类抗生素耐药率较高,而对阿米卡星耐药率较低；耐药模式以双药耐药和多重耐药为主。 2、外排泵基因acra/acrb基因在4种耐药模式的大肠埃希菌临床株中普遍存在,其中,在多重耐药组中阳性率最高分别为84.6%和80.8%,在全敏感组阳性率最低分别为41.7%和33.3%。二者差异具有统计学意义(P0.05)。 3、多数细菌具有主动外排作用,CCCP能有效抑制细菌对抗菌药物的主动外排作用,MIC下降倍数不等,说明外排泵主动外排作用大小不等,或主动外排机制可能与其它机制一起导致大肠杆菌抗菌药物多重耐药。
【关键词】：大肠埃希菌 多重耐药 外排泵 耐药-结分-裂家族 羰基-氰-间-氯苯腙
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.21
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• ~.略语/符号说明12-14
• 前言14-22
• 研究现状、成果14-21
• 研究目的、方法21-22
• 一、大肠埃希菌临床株的耐药谱分析及药敏表型分组22-29
• 1.1 对象和方法22-25
• 1.1.1 材料22-23
• 1.1.2 方法23-25
• 1.2 结果25-26
• 1.2.1 大肠埃希菌临床株的标本来源25
• 1.2.2 大肠埃希菌体外药物敏感试验结果25
• 1.2.3 大肠埃希菌临床株耐药模式分组25-26
• 1.3 讨论26-28
• 1.4 小结28-29
• 二、大肠埃希菌临床株多重耐药外排泵基因acra、acrb的检测及统计学分析29-38
• 2.1 对象和方法29-33
• 2.1.1 材料29-30
• 2.1.2 方法30-33
• 2.2 结果33-34
• 2.2.1 外排泵基因PCR结果33-34
• 2.2.2 统计学分析34
• 2.2.3 基因测序结果34
• 2.3 讨论34-36
• 2.4 小结36-38
• 三、质子泵抑制剂CCCP对多重耐药大肠埃希菌MIC的影响38-45
• 3.1 材料与方法38-40
• 3.1.1 材料38-39
• 3.1.2 方法39-40
• 3.2 结果40-43
• 3.3 讨论43-44
• 3.4 小结44-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 发表论文和参加科研情况说明50-51
• 综述51-64
• 综述参考文献57-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：645971