重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的构建及应用

发布时间：2017-08-11 18:31

  本文关键词：重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的构建及应用

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【摘要】：目的构建人盘状结构域受体2(DDR2)与IgG Fc段嵌合受体的重组质粒(pFLAG-CMV2-Fc DDR2),检测其自主磷酸化水平。方法设计Fc DDR2克隆引物,以质粒pSec Tag2B-Fc DDR2为模板,PCR扩增IgG Fc段与DDR2跨膜区和胞内区的c DNA序列(Fc DDR2),将其插入pFLAG-CMV2真核表达载体中。PCR扩增鉴定并测序验证重组质粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2后,将其转染人胚肾HEK293T细胞,Western blot法验证HEK293T细胞中目标蛋白Fc DDR2的表达效率。将pcDNA3.1-DDR2转染HEK293T细胞,给予2型胶原蛋白刺激后作为阳性对照,用小鼠来源抗DDR2抗体免疫沉淀`pFLAG-CMV2-Fc DDR2阳性的HEK293T细胞及胶原刺激的pcDNA3.1-DDR2阳性的HEK293T细胞,4G10抗体分析DDR2的磷酸化水平,评价Fc DDR2的自主磷酸化能力。结果重组质粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2的PCR扩增产物为大小约2800 bp左右的片段,与预期相符,测序验证正确。Western blot结果提示pFLAG-CMV2-Fc DDR2转染后的HEK293T细胞,FLAG-Fc DDR2表达水平显著上调。免疫沉淀结合Western blot分析提示FcDDR2的磷酸化水平与胶原刺激后的DDR2水平相当。结论成功构建了pFLAG-CMV2-FcDDR2真核表达载体,Fc DDR2的自主磷酸化与胶原蛋白刺激后DDR2的活化水平相当,可以用作DDR2经胶原蛋白刺激后的活化替代形式。
【作者单位】： 第四军医大学药学系生物制药学教研室;宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系;第四军医大学基础部教学实验中心;
【关键词】： 重组质粒 FcDDR HEKT细胞 胶原刺激 磷酸化
【基金】：国家自然科学基金(81260460,81302560,81273279,81373201) 宁夏医科大学特殊人才启动项目(XT2012005) 陕西省自然科学基金(2012K-03-05)
【分类号】：R392
【正文快照】： 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节软骨破坏为重要特征的自身免疫性疾病[1]。研究表明,RA关节软骨破坏进程中存在基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)过度分泌的现象[2],而关节滑膜组织中高表达的盘状蛋白结构域受体2(discoindin domain recept

【共引文献】

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本文编号：657625