结核分枝杆菌RD1蛋白PE35经TLR2干扰IL-1β信号传递

发布时间：2017-08-11 19:06

  本文关键词：结核分枝杆菌RD1蛋白PE35经TLR2干扰IL-1β信号传递

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【摘要】：结核分枝杆菌是结核病的致病菌,是历史上最成功的致病菌之一,全球约1/3的人口感染过结核菌,每年约150万人死于结核菌感染。耐药结核分枝杆菌的出现和与HIV的共感染更加剧了结核病控制形势。 PE家族作为结核菌基因组中一个独特的家族。PE家族基因有两个亚家族：PE和PE_PGRS.目前为止,有许多PE_PGRS亚家族的功能的研究,包括改变细胞结构和菌落形态,作为酯酶为迟留的分枝杆菌提供能量,与抗原变异有关,维持结核分枝杆菌在肉芽肿中的迟留状态。然而,PE家族的蛋白在结核分枝杆菌致病性中的功能仍然是未知的。PE35,一个PE家族成员,同时属于RD1,在致病的分枝杆菌种是较保守的,在减毒株BCG中是不存在的,推测其可能与结核分枝杆菌的毒力相关。 位于天然免疫细胞上的不同的模式识别受体(PPRs)识别分枝杆菌组分,引起细胞因子的诱导,从而有利于感染的早期控制。许多细胞因子与结核分枝杆菌的控制有关,如IL-12p70, IL-23, IL-27, IL-35, IL-1α, IL-1β,IL-18, IL-33,TNF-a, IFN-y, Type IIFNs,IL-17,Th17-相关细胞因子,IL-10和其他的免疫抑制细胞因子。我们研究PE35在巨噬细胞中促炎细胞因子产生中的作用及其涉及的信号通路。以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增PE35基因,把PCR胶回收产物与pMD19-T载体相连,再亚克隆进pEGFP-C1质粒上。重组的pEGFP-C1-PE35质粒被转染进RAW264.7细胞中。用LPS预处理RAW264.7细胞,通过实时定量荧光PCR和ELISA检测了细胞因子的表达。此外,我们也通过免疫印迹实验鉴别了引起细胞因子减弱表达的信号通路。最后,我们也进行了验证PE35与TLR2相互作用的pull down实验。 PE35在巨噬细胞中减弱了LPS诱导的促炎的细胞因子IL-1β的产生,这种效应不依赖于p38MAPK和Erk1/2途径。而且, pull down实验发现了PE35与TLR2的相互作用。IL-1β在细胞适应性反应中诱导Th17极化。总之,这些结果表明,PE35可能作为一个新的TLR2配体,通过降低IL-1p的产生减弱Th17适应性反应,从而有利于结核分枝杆菌的入侵。
【关键词】：PE35 TLR2 IL-1β 结核分枝杆菌 转染
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q78;R378.911
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第1章 综述12-18
• 1.1 结核病与人类健康12
• 1.2 分枝杆菌与TLR2的相互作用12-13
• 1.3 IL-1β的产生,加工分泌,及其在MTB感染控制中的作用13-15
• 1.3.1 IL-1β在宿主的天然免疫中的作用及与之相关的疾病13
• 1.3.2 激活IL-1β表达的病原体相关分子模式13-14
• 1.3.3 IL-1β的加工和分泌14-15
• 1.3.4 IL-1β的作用15
• 1.4 MAPK调控IL-1β的表达15-17
• 1.4.1 MAPK简介15-16
• 1.4.2 p38 MAPK16
• 1.4.3 ERK1/216
• 1.4.4 PI3K-Akt途径16-17
• 1.5 PE家族和PE3517-18
• 第2章 前言18-19
• 第3章 实验材料和方法19-34
• 3.1 实验材料19-24
• 3.1.1 实验菌株、质粒和细胞19
• 3.1.2 培养基和主要试剂19-24
• 3.1.3 主要仪器24
• 3.2 实验方法24-34
• 3.2.1 结核分枝杆菌PE35基因(Rv3872)PCR引物的设计与合成24
• 3.2.2 结核分枝杆菌PE35基因(Rv3872)扩增24-25
• 3.2.3 PCR扩增产物的柱式胶回收纯化25
• 3.2.4 Rv3872基因的TA克隆25-26
• 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化26
• 3.2.6 质粒的提取26
• 3.2.7 Rv3872基因亚克隆至pET-28,pEGFP-C1质粒,并转化至大肠杆菌DH5α菌株中26-27
• 3.2.8 脂质体转染27-28
• 3.2.9 转染细胞的筛选28
• 3.2.10 GFP,GFP-PE35融合蛋白在转染RAW264.7细胞中的鉴定28-29
• 3.2.11 LPS处理29
• 3.2.12 细胞上清的收集29
• 3.2.13 RAW264.7细胞培养29
• 3.2.14 ELISA实验29-30
• 3.2.15 western blot分析30-31
• 3.2.16 cDNA合成31-32
• 3.2.17 实时定量荧光实时定量荧光PCR32
• 3.2.18 Pull down分析试剂32
• 3.2.19 纯化天然His标签蛋白32-33
• 3.2.20 数据处理33-34
• 第4章 结果与分析34-43
• 4.1 pEGFP-C1-PE35重组质粒的构建34-35
• 4.1.1 Rv3872基因的PCR扩增和鉴定34
• 4.1.2 重组质粒T-PE35的鉴定34
• 4.1.3 在大肠杆菌DH5α菌株中构建并鉴定重组质粒pEGFP-C1-PE3534-35
• 4.2 转染的RAW264.7细胞中的pEGFP-C1和重组质粒pEGFP-C1-PE #35的鉴定35-37
• 4.2.1 瞬时转染细胞的获得35
• 4.2.2 获得稳定表达PE35蛋白的RAW264.7细胞系35-36
• 4.2.3 PE35基因整合进RAW264.7细胞的基因组中36
• 4.2.4 PE35基因在RAW264.7细胞中成功转录36-37
• 4.2.5 PE35蛋白在稳定转染的RAW264.7细胞中表达37
• 4.3 PE35降低LPS诱导的IL-1β产生37-38
• 4.4 PE35减弱IL-1β表达的能力不依赖于p38 MAPK和ERK1/2途径38-39
• 4.5 pET-28-Rv3872融合蛋白的表达,纯化和鉴定39-41
• 4.5.1 Rv3872基因的PCR扩增和鉴定39-40
• 4.5.2 在大肠杆菌DH5α菌株中构建并鉴定重组质粒pET-28-Rv3872重组质粒40
• 4.5.3 在大肠杆菌BL21菌株中构建并鉴定重组质粒pET-28-Rv387240-41
• 4.5.4 pET-28-Rv3872重组蛋白表达和纯化41
• 4.6 在RAW264.7中,PE35蛋白能与TLR2结合41-43
• 第5章 结论与展望43-46
• 5.1 实验结论与分析43-44
• 5.2 展望44-46
• 参考文献46-50
• 致谢50-52
• 在学期间所发表的文章52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 时欣欣;鲍朗;邱云青;郭思;;结核分枝杆菌毒力分泌基因Rv3872重组卡介苗的构建及表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2010年06期

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本文编号：657753