新生大鼠骨骼肌肌源性干细胞的分离、纯化、培养和鉴定

发布时间：2017-08-14 21:30

  本文关键词：新生大鼠骨骼肌肌源性干细胞的分离、纯化、培养和鉴定

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【摘要】：目的：肌源性干细胞（muscle derived-stem cells，MDSCs）移植治疗压力性尿失禁（SUI）的研究深受关注，传统的治疗方法长期疗效不理想且并发症多，随干细胞研究的深入，干细胞移植成为肌肉组织损伤修复的一种重要手段，同时也为SUI的根本治疗带来希望。其中MDSCs倍受关注，它是肌肉中一种高度未分化的多潜能干细胞，具有体外分裂增殖快、自我更新、多向分化潜能和移植后存活率高等特点。并且取材资源丰富，操作方便，安全性高，是一种理想的种子细胞。由于肌肉组织中MDSCs数量少，所以MDSCs的分离和体外培养是进行移植的关键。本实验运用改良酶消化法和差速贴壁法分离纯化出MDSCs，通过细胞免疫组织化学染色进行鉴定，并对其体外培养进行密切观察，掌握稳定的分离纯化和培养方法，为将来移植治疗SUI提供重要的实验依据。 方法： 1骨骼肌细胞的消化分离：实验动物为清洁级新生SD（Sprayue-Dawley）大鼠，雌雄不限。75%酒精浸泡窒息处死后，取下四肢骨骼肌并剪成碎块（约1mm~3），PBS缓冲液吹打冲洗，静置后去除上清液，加入约2倍体积的混合酶（2.4u/ml Dispase II、0.5%I型胶原酶，2.5mmol/L CaCl2），37℃水浴箱消化约1小时，加入生长培养基终止消化，过滤后离心弃上层液，重悬细胞后进行培养（37℃，5%CO2）。 2MDSCs的分离、纯化和培养：培养2小时后贴壁细胞记为PP1，将上层液中未贴壁的细胞吸出后继续培养。24小时后，贴壁细胞记为PP2。每24小时进行差速贴壁培养，直到获得PP6。PP6培养3天后换液，每2~3天换液1次，待70~80%融合后传代培养。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，加入胎牛血清终止消化，按1:2的比例进行传代培养。 3MDSCs生长曲线的测定：取MDSCs传代培养的一代、四代和七代细胞，0.25%胰酶消化后，以3×10~4个/ml的密度接种于24孔培养板，每日随机选取3孔进行细胞计数，共记录8日，取平均值绘制细胞生长曲线。 4MTT比色法观察不同接种密度对MDSCs生长的影响：取MDSCs传代细胞，调节细胞密度分别为2、4、6、8、10、12、15×10~5个/ml，接种于96孔培养板中，培养48小时后，每孔加入20ulMTT（5mg/ml），37℃避光培养4小时后弃上清液，每孔加入100ul二甲基亚砜（DMSO），振荡10分钟使结晶物完全溶解，在490nm处检测吸光度值。 5MDSCs的鉴定：对获取的MDSCs（PP6）以及MDSCs传一代、四代、七代进行Desmin、Sca-1抗体免疫细胞化学染色，对PP1~PP6进行Desmin免疫细胞化学染色，以成纤维细胞作为阴性对照，在显微镜下观察，以胞膜和/或胞浆内出现棕黄色颗粒判定为阳性，每组选取不同的视野进行计算阳性细胞占细胞总数的百分比。 6统计学处理：使用SPSS13.0统计软件处理实验数据，并进行统计学分析，P0.05认为有统计学意义。 结果：1MDSCs的消化、分离、纯化和细胞形态 骨骼肌经过混合酶消化后得到肌纤维碎片、骨骼肌细胞、血细胞、成纤维细胞和内皮细胞等的混合物，用差速贴壁法将快速贴壁细胞与慢速贴壁细胞逐步分离，便可获得MDSCs。PP1、PP2以成纤维细胞为主，细胞数量多，贴壁迅速，增殖快，5天左右完全融合；PP3、PP4以肌细胞为主，数量减少，增殖较快，1周左右完全融合；PP6贴壁的细胞数量明显减少，多为小圆形或梭形，体积较小，折光性好，增殖缓慢，另有少量悬浮的细胞。培养72小时后细胞数量增多，呈现梭形或纺锤形，有小克隆团形成，分散生长在瓶底。1周左右细胞明显分裂增殖，数量增多，密度增加，形成众多细胞团，呈簇状生长，细胞簇之间有明显的界限，贴壁细胞展开生长呈梭形、纺锤性或多角形，细胞质少，胞核增大。10天左右细胞继续增殖，呈长梭形，细胞之间相互融合，细胞簇体积增大并相连成片，细胞间隙变小。2MDSCs传代细胞的生长曲线 生长曲线呈现S形，经过滞留期、对数生长期和平台期。培养2天内细胞分裂扩增不明显，生长速度较慢；3天后细胞扩增明显，生长速度加快，进入对数生长期；6天后细胞增殖受到抑制，生长变慢，进入平台期。传第一代细胞增殖速度快于传四代和七代细胞，同时随传代次数增多，细胞增殖速度逐渐下降。3不同接种密度对MDSCs生长的影响 在一定细胞数范围内，吸光度数值与细胞数成正比。在1×10~6个/ml密度接种时吸光度值最大，细胞数量最多，活性较好，有利于细胞的生长和传代培养。4MDSCs的鉴定 MDSCs对Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色均呈阳性表达，，光镜下胞膜胞浆呈现棕黄色，成纤维细胞呈阴性反应。PP1~PP6中Desmin的阳性表达率逐渐升高，PP6中两者阳性表达率均在90%以上。MDSCs传一代、四代和七代的细胞中均对Desmin和Sca-1均呈阳性表达，表达率均在80%以上。 结论： 通过改良混合酶消化法和差速贴壁技术（preplate），可以获得新生SD大鼠的MDSCs，传三代内的MDSCs分裂增殖显著，细胞活性较好，生长速度较快，在合适的接种密度和培养条件中细胞分裂增殖最好，可获得较多数目的细胞，Desmin和Sca-1可以鉴定MDSCs，传至第七代的细胞仍保持较高的活性。
【关键词】：肌源性干细胞 差速贴壁 免疫细胞化学染色 原代培养 生长曲线
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11
• 材料与方法11-16
• 结果16-19
• 附图19-28
• 附表28-30
• 讨论30-35
• 结论35
• 参考文献35-38
• 综述 骨骼肌肌源干细胞的特性及应用的研究进展38-50
• 参考文献46-50
• 致谢50-51
• 个人简历51

【参考文献】

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1 施向挺;刘颖;华咏;陈卫华;王跃闽;;大鼠腓肠肌肌源细胞的培养与鉴定[J];同济大学学报(医学版);2009年02期

2 叶锦;靳风烁;陈锦;王鹏;梁培禾;聂志林;李黔生;;大鼠肌源性干细胞的分离、纯化和培养[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年14期

3 丁维进;唐乙;宋艳玲;苏志达;李翠;刘安堂;胡霞;江华;;应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年36期

本文编号：674812