EGFP示踪兔BMSCs向神经元样细胞分化的实验研究

发布时间：2017-08-15 09:42

  本文关键词：EGFP示踪兔BMSCs向神经元样细胞分化的实验研究

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【摘要】：目的采用脂质体法将含增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescentprotein，EGFP）基因的MmiR3407-MR03重组质粒转染至兔骨髓间充质干细胞（bone marrow derived stroma cells，BMSCs）得到稳定表达EGFP基因的BMSCs系，再用睫状神经节神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）定向诱导分化，以探讨EGFP基因标记对兔BMSCs体外诱导分化为神经元样细胞等生物学特性的影响，以期为BMSCs的体内移植提供有效的示踪方法。 方法选用新生新西兰白兔，取其骨髓用密度梯度离心法结合贴壁法进行细胞原代培养，通过传代将BMSCs扩增纯化。采用免疫细胞化学方法检测兔BMSCs的CD34、CD44、CD54抗体的表达情况。按照高纯度质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒DNA。确定G418的最佳筛选浓度后选取第3-5代兔BMSCs，采用阳离子脂质体介导法进行转染，并计算转染效率。G418筛选得到稳定转染EGFP基因的兔BMSCs，并观察细胞生长情况。取第3-5代的EGFP-BMSCs和第3-5代的BMSCs，，分为四组：EGFP-BMSCs诱导组、BMSCs诱导组、EGFP-BMSCs空白组和BMSCs空白组。EGFP-BMSCs诱导组、BMSCs诱导组均先用10ng/mlbFGF预诱导24h，再用10ng/mlCNTF诱导12h；EGFP-BMSCs空白组和BMSCs空白组均无特殊处理。观察四组细胞形态变化，采用MTT法检测四组细胞活性，采用免疫细胞化学方法检测四组细胞的巢蛋白（nestin）和神经元特异性烯醇化酶(NES)的表达情况，并比较两诱导组之间、两空白组之间及各细胞诱导前后组之间细胞的形态、细胞活力及神经元特异性标记物阳性细胞率。 结果 1.原代兔BMSCs贴壁生长，多呈纺锤形，漩涡样生长。传代后细胞形态逐渐趋于一致，以梭形为主，胞体饱满，排列更加有序。传至10代，细胞逐渐老化。 2.免疫细胞化学鉴定结果显示所培养细胞的CD44, CD54呈阳性表达，而CD34表达呈阴性，符合BMSCs的免疫表型特点。 3.脂质体介导含EGFP基因的MmiR3407-MR03质粒转染BMSCs后，转染12h，荧光显微镜下可观察到少量细胞发出绿色荧光，转染48h时转染率最高，近30%，之后72h内随时间变化不大。经G418筛选后可得到稳定表达EGFP的BMSCs系。 4.CN TF诱导12h后，可见细胞胞体伸出2个或多个细长突起，折光性强，类似神经元形态，荧光显微镜下仍可见明亮的绿色荧光。MTT法结果显示：24h、48h和72h BMSCs诱导组、EGFP-BMSCs诱导组、EGFP-BMSCs空白组、BMSCs空白组的OD值比较差异均无统计学意义（P＞0.05）； 5.免疫细胞化学检测显示EGFP-BMSCs诱导组的NSE阳性细胞率、nestin阳性细胞率分别为（49.983.07）%、（48.741.32）%；BMSCs诱导组的NSE阳性细胞率、nestin阳性细胞率分别为（48.443.97）%、（47.861.68）%；EGFP-BMSCs空白组和BMSCs空白组的NSE、nestin阳性细胞率均较小。EGFP-BMSCs诱导组、BMSCs诱导组两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；EGFP-BMSCs空白组和BMSCs空白组两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；BMSCs诱导组、BMSCs空白组两组间差异有明显统计学意义（P＜0.05）；EGFP-BMSCs诱导组、EGFP-BMSCs空白组两组间差异有明显统计学意义（P＜0.05）。 结论 1.通过脂质体法可得到稳定表达EGFP的兔BMSCs系，EGFP基因标记可能为BMSCs移植提供一种有效的示踪方法； 2.EGFP基因标记的兔BMSCs可诱导分化分化为神经元样细胞，其生物学特性无影响； 3.睫状神经节神经营养因子干预后稳定表达EGFP的兔BMSCs可定向分化为神经元样细胞。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 增强型绿色荧光蛋白 神经元样细胞
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 主要英文缩略语索引4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 材料13-17
• 第一部分 兔 BMSCs 体外培养及 EGFP 基因转染的研究17-26
• 方法17-22
• 结果22-26
• 第二部分 EGFP 标记的 BMSCs 向神经元样细胞分化的影响26-32
• 方法26-28
• 结果28-32
• 讨论32-36
• 结论36
• 本研究创新性的自我评价36-37
• 参考文献37-41
• 综述41-47
• 参考文献45-47
• 读研究生期间发表的论文47-48
• 致谢48

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