骨髓间充质干细胞Toll样受体4激活对B细胞活化因子的影响

发布时间：2017-08-15 15:26

  本文关键词：骨髓间充质干细胞Toll样受体4激活对B细胞活化因子的影响

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【摘要】：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMMSC)在其Toll样受体(Toll like receptor, TLR)激活状态下,可以分化为两种亚型MSC1和MSC2。MSC1型指骨髓间充质干细胞的TLR4激活后其可以增高表达促进T淋巴细胞功能的分子,而TLR3激活后的MSC即MSC2型可以产生抑制T淋巴细胞免疫反应的因子。BMMSC在不同TLRs激活下分别具有促进或者抑制T淋巴细胞免疫功能的能力逐渐引起关注,并且TLRs激活后是否会影响BMMSC对B淋巴细胞功能相关的研究比较少。本课题主要研究了人和小鼠骨髓间充质干细胞的不同种类的TLRs激活后对其产生的B淋巴细胞活化分子(B cell-activating factor belonging to the TNF family, BAFF)的影响。研究发现人和小鼠的BMMSC的TLR4激活可以增高BAFF的表达,而TLR2和TLR3则对BAFF的表达没有影响,且该现象与MSC1和MSC2亚型分别具有的对免疫系统不同的作用相一致。并且NF-ΚB, p38 MAPK和JNK三条通路均参与了BAFF的产生。骨髓间充质干细胞特定的TLRs激活后可以产生促进B淋巴细胞功能的因子,可以进一步研究BMMSC的促免疫功能及特定亚群,以便可以更好地应用于治疗免疫相关的疾病中。第一部分人和小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养、特性鉴定目的 分离、培养人和小鼠BMMSC,并鉴定其多向分化能力以及免疫表型方法 分别用密度梯度离心法和贴壁细胞筛选法分离人和小鼠原代骨髓间充质干细胞,取P3-P5代细胞。用成脂肪培养基持续诱导14天,倒置显微镜观察拍照,并用油红O染色检测其脂滴的形成。用成骨细胞培养基诱导21天后倒置显微镜观察拍照,并用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)检测其诱导结果。用流式细胞术鉴定其表面分子标志。结果 人和小鼠BMMSC在培养第14天左右细胞达90%融合,呈长梭形涡样生长。人和小鼠BMMSC诱导第14天油红O染色显示胞浆内的脂滴被染成亮红色。人和小鼠BMMSC成骨诱导第21天后可检测到胞质中含较多紫蓝色碱性粒酸酶颗粒。流式细胞术检测P3代小鼠BMMSC细胞表面标志分子,结果显示小鼠BMMSC弱阳性表达CD106,强阳性表达Sca-1 (stem cell antigen-1)、CD44,并且不表达血细胞的标志CD34、CD45、CD31。同样的方法检测P3代人BMMSC细胞表面标志,结果显示人BMMSC均高表达CD90、CD44、CD105,而不表达血细胞的标志CD34、CD45、CD31。第二部分TLR2和TLR4对小鼠骨髓间充质干细胞多向分化能力影响的比较目的 研究TLR2和TLR4对小鼠BMMSC的多向分化能力的影响。方法 用zymosan作为TLR2的激动剂,LPS作为TLR4的激动剂。分别诱导小鼠BMMSC成脂肪和成骨分化,每两天换液一次,换液同时分别加上述TLRs激动剂(1μg/ml)。并分别于诱导后14天、21天检测其成脂,成骨分化效果。结果 诱导同时加TLRs激动剂的实验组在诱导第14天用油红O染色检测,胞浆内的脂滴被染成亮红色。诱导同时加TLRs激动剂的BMMSC在成骨诱导第21天可检测到胞质中含较多紫色碱性磷酸酶阳性颗粒。TLR2和TLR4激活均不影响小鼠BMMSC的成脂和成骨分化能力。第三部分TLR2, TLR3, TLR4对人和小鼠间充质千细胞B细胞激活因子(BAFF)表达的影响及其作用机制探讨目的 研究TLR2, TLR3,和TLR4激活对人和小鼠BMMSCB细胞激活因子(BAFF)的产生的影响及其作用机制。方法 先用0,0.1μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml浓度的LPS作用于小鼠BMMSC48小时。用zymosan, LPS (1μg/ml)分别刺激小鼠BMMSC 48小时。用zymosan, Poly(I:C), LPS (1μg/ml)分别刺激人BMMSC48小时。用封闭实验验证TLRs受体的作用,分别使用TLR2,和TLR4的封闭抗体anti-TLR2和anti-TLR4以2μg/ml的浓度37-C分别作用30分钟,接着分别用TLR2和TLR4的激动剂分别刺激48小时后检测BAFF的表达。用三种TLR4通路的抑制剂PDTC (Pyrrolidinedithiocarbamic acid, NF-κB通路抑制剂),SP600125(JNK通路抑制剂),SB203580(p38 MAPK通路抑制剂),以1μM的浓度37-C分别作用30分钟,接着用LPS作用(1μg/ml)刺激48小时,用real time PCR和western blot检测上述几组细胞的BAFF的表达。用免疫荧光法观察NF-κB通路激活后该蛋白的核转位现象。结果BAFF的表达并不完全是剂量依赖性增高,当LPS的作用浓度为1μg/ml时小鼠BMMSC的BAFF表达最高。小鼠BMMSC的TLR4激活后,BAFF表达上升2-3倍(p0.05),而TLR2激动剂作用后,BAFF表达只有少量上升(p0.05)。人BMMSC的TLR4激活后,BAFF表达上升2-3倍(p0.05),而TLR3和TLR2激动剂作用后只有微量上升,且没有统计学意义。TLR4封闭后BAFF下降了53.2±12.2%(p0.05)。NF-κB, JNK通路和p38 MAPK通路抑制后BAFF表达比TLR4激活分别下降了90.4±2.4%,87.0±7.2% and 97.9±4.8%。综上所述,本研究(1)鉴定了分离的人和小鼠原代BMMSC的特性。(2)选用zymosan和LPS分别作为TLR2和TLR4的激动剂,二者均不影响小鼠BMMSC的成骨,成脂分化能力。(3)小鼠和人BMMSC的TLR4通路激活后,其BAFF的表达增高了2-3倍。而TLR2和TLR,3激活后没有影响BAFF的表达。(4),JNK通路,NF-κB通路和p38 MAPK三条通路均参与了BAFF的产生过程。(5)TLR4通路激活后,NF-κB通路有核转位现象。
【关键词】：间充质干细胞 促免疫功能 LPS TLR4 BAFF
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-12
• 第一部分 人和小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养、特性鉴定12-20
• 材料和方法12-15
• 结果15-19
• 讨论19-20
• 第二部分 TLR2和TLR4对小鼠骨髓间充质干细胞多向分化能力的影响20-24
• 材料和方法20-21
• 结果21-23
• 讨论23-24
• 第三部分 TLR2,TLR3,TLR4对人和小鼠间充质干细胞B细胞激活因子(BAFF)表达的影响及其内在机制探讨24-39
• 材料和方法24-29
• 结果29-35
• 讨论35-39
• 结论39-40
• 参考文献40-43
• 致谢43-44
• 附录44-46
• 附录1 英文缩略语44-45
• 附录2 硕士期间发表的文章45-46
• 综述46-54
• 参考文献52-54

【共引文献】

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本文编号：678911