局部RAS介导缺氧诱导的骨髓间充质干细胞VEGF分泌及体外血管生成

发布时间：2017-08-16 08:18

  本文关键词：局部RAS介导缺氧诱导的骨髓间充质干细胞VEGF分泌及体外血管生成

  更多相关文章： 局部RAS MSCs 缺氧 VEGF Akt ERK 局部RAS MSCs 内皮细胞特异性标识物 血管生成

【摘要】：第一部分局部RAS对缺氧诱导的骨髓间充质干细胞VEGF表达的影响 背景：间充质干细胞（MSCs）是一种具有多向分化潜能、免疫调控和自我复制等特点的干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等。MSCs可用于治疗多种血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病等。缺血性心脏病在世界范围内的致死率高居不下，其特点是心肌细胞的凋亡、心室重构、最终导致心力衰竭。由于MSCs易于提取分离和体外扩增、具有潜在的分化为心肌细胞和内皮细胞的能力、能够旁分泌生长因子，已成为治疗缺血性心脏病的研究热点。众多的研究已表明在心肌梗死后移植MSCs可减轻心室重构，增加梗死部位的血管密度，从而显著的提高心功能。但是移植后MSCs的低存活率限制了其治疗效率，绝大多数MSCs在移植后数天内即已凋亡。 肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensinsystem, RAS）包括肾素、血管紧张素转换酶（ACE）、血管紧张素II （AngII）等，RAS既存在于循环系统中，也存在于血管壁、心脏、中枢、肾脏等局部组织中，，共同参与对靶器官的调节。在MSCs中也存在RAS系统，其生理功能和病理变化尚未明晰。我们曾发现外源性的AngII可以通过AT1受体诱导MSCs分泌血管内皮生长因子（VEGF）。由于VEGF可通过提高细胞存活和血管生成能力介导MSCs在梗死心脏内的保护作用，因此提高VEGF的表达与生成具有意义。已知缺氧是一种诱导MSCs分泌VEGF的方法，而缺氧诱导的VEGF表达是通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）介导，HIF-1α的表达又可以通过Akt和ERK通路进行调节。但是缺氧是否会引起MSCs内RAS表达改变，以及改变局部RAS是否影响缺氧诱导的VEGF的表达均未见报道。 目的：探讨缺氧后MSCs内部RAS的变化及其对缺氧诱导的VEGF表达的影响 及其机制。 方法：第三代MSCs缺氧24h后，用Real-time PCR方法检测MSCs内AT1、AT2、ACE的表达；放射免疫的方法检测缺氧后培养基中的AngⅡ的浓度；应用血管紧张素1型受体(AT1)拮抗剂氯沙坦(losartan)、血管紧张素2型受体（AT2）拮抗剂PD123319进行干预观察两者对缺氧诱导MSCs VEGF表达的影响，同时观察两者对Akt和ERK1/2磷酸化水平及HIF-1α表达水平的影响；用Akt特异性抑制剂LY294002和ERK特异性抑制剂U0126进行干预观察两者对HIF-1α表达水平和缺氧诱导MSCs VEGF表达的影响。 结果：缺氧24小时后MSCs内AT1、AT2、ACE表达水平较对照组均显著升高，AngⅡ的分泌也同样显著增高；losartan抑制了缺氧诱导的HIF-1α及VEGF表达水平、Akt和ERK1/2的磷酸化水平；LY294002及U0126抑制了缺氧诱导的HIF-1α及VEGF表达水平。 结论：缺氧后MSCs内部RAS表达水平增高，增高的AngⅡ通过AT1受体及下游的Akt、ERK及HIF-1α通路调节VEGF的表达。 第二部分局部RAS对骨髓间充质干细胞体外血管生成能力的影响 背景：缺血性心脏病如心肌梗死的特征主要是不可逆的心肌细胞凋亡，细胞移植近年来被认为是一种有效治疗方法。间充质干细胞（MSCs）是一种来源于发育早期中胚层和外胚层的干细胞，具有多分化潜能，在特定的诱导条件下可以分化为心肌、脂肪、骨、内皮等细胞。许多的研究报道MSCs移植可以降低缺血心脏的梗死面积，增加血管密度，增加射血分数等。MSCs在治疗心肌梗死时主要的机制有向心肌细胞和内皮细胞分化，旁分泌等，这些机制在MSCs移植后可同时存在。 尽管研究者们志在努力提高MSCs向心肌细胞的分化率，但截至目前MSCs仍不能完全分化为成熟的心肌细胞，只是分化为表达一定心肌特异性基因的心肌样细胞。在这种情况下，促进新生血管形成可能在MSCs的治疗作用中起主要作用。MSCs的新生血管作用来源于向内皮细胞分化和旁分泌生长因子。MSCs向内皮细胞定向分化的方法包括与内皮细胞共培养、辛伐他汀、VEGF诱导等，其中以内皮细胞生长培养基中加入VEGF和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行定向诱导较为常用。另外，有研究指出血清剥夺MSCs长期培养后可以表达内皮细胞特异性标识物，且具有较强的血管生成能力。而大鼠骨髓MSCs在正常培养条件下能否自发表现出一定的血管生成能力，局部RAS能否调节这种血管生成能力还未见报道。 目的：探讨MSCs在正常培养过程中血管生成能力的变化及局部RAS对BMSCs血管生成能力的影响。 方法：分离培养大鼠MSCs，分第3代对照、第7代对照、AngII、AngII+losartan、AngII+PD123319组进行实验。用Real-time PCR、体外血管生成试剂盒（Matrigel）及免疫荧光染色方法检测各组细胞的内皮细胞特异性标识物表达水平及血管生成能力。 结果：1.在培养至第7代后，正常培养的MSCs部分在形态上呈椭圆形；2.正常培养的第7代细胞内皮细胞特异性标识物的表达水平及血管生成能力明显高于第3代细胞；3. AngII不能增加MSCs的血管生成能力；AngII+losartan可显著降低MSCs的血管生成能力；AngII+PD123319则显著增加了MSCs的血管生成能力。 结论：MSCs在体外正常培养条件下会自发的表达部分内皮细胞特异性标识物，表现出一定的血管生成能力；局部RAS可以调节MSCs的血管生成能力。
【关键词】：局部RAS MSCs 缺氧 VEGF Akt ERK 局部RAS MSCs 内皮细胞特异性标识物 血管生成
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 第一部分 局部 RAS 对缺氧诱导的骨髓间充质干细胞 VEGF 表达的影响12-37
• 1 引言12-16
• 2 材料和方法16-22
• 3 结果22-28
• 4 讨论28-30
• 参考文献30-37
• 第二部分 局部 RAS 对骨髓间充质干细胞血管生成能力的影响37-53
• 1 引言37-38
• 2 材料和方法38-43
• 3 结果43-47
• 4 讨论47-49
• 参考文献49-53
• 综述53-70
• 参考文献61-70
• 附录70-71
• 攻读硕士学位期间发表文章情况71-72
• 致谢72

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本文编号：682214